Kompetitive chemoproteomische Profilierung von Proteinzielen für kovalente niedermolekulare Arzneimittel

Technische Merkmale der Plattform

Ähnlich wie bei nichtkovalenten Arzneimitteln wurde die direkte Pulldown-Strategie unter Verwendung chemischer Sonden, die mit Reportergruppen funktionalisiert sind, auch für kovalente niedermolekulare Arzneimittel erfolgreich demonstriert.Es ist jedoch zu beachten, dass einige kovalente Arzneimittel aufgrund des Verlusts der Bioaktivität oder der Unzugänglichkeit für die Synthese chemische Modifikationen nicht vertragen.Darüber hinaus ist die gebildete kovalente Bindung während der MS-Detektion normalerweise instabil.

Die kompetitive chemoproteomische Strategie ist eine ideale Alternative, die eine universelle aktivitätsbasierte Sonde zur Proteinmarkierung verwendet.Es wurden spezielle chemische Sonden entwickelt, die mit Cystein-, Lysin-, Serin- und Histidinresten reagieren.Im Prinzip kann der Aminosäurerest, sobald er von einem kovalenten kleinen Molekül besetzt ist, nicht mehr durch die Sonde markiert werden.Dadurch konnten die ON- und OFF-Targets durch diese kompetitive Strategie mit der Aminosäureauflösung umfassend identifiziert werden.

Arbeitsablauf

Die Plattform folgt einem strukturierten Arbeitsablauf, der mit der Markierung lebender Zellen mit kovalenten Molekülen beginnt, gefolgt von Schritten wie der Extraktion markierter Proteome, der Markierung chemischer Sonden, der bioorthogonalen Ligation, der Streptavidin-basierten Anreicherung, dem Proteaseverdau, der Isotopenmarkierung und der abschließenden massenspektrometrischen Erkennung.

Fallstudie

Projektziel

AMG510, entwickelt von Amgen, ist das erste zugelassene Medikament, das auf die KRAS-G12C-Mutation in Tumoren abzielt.Das Ziel des Projekts bestand darin, die On- und Off-Ziele von AMG510 in NCI-H358-Zellen mit der KRAS-G12C-Mutation zu profilieren.

Experimentelle Methode

DIA-ABPP, eine der zentralen Technologieplattformen in ChomiX, wurde zur Analyse der Zielbelegung auf Proteomebene verwendet.

Datenvisualisierung

Insgesamt wurden 16992 Cys-Stellen von 5768 Proteinen in NCI-H358-Zellen quantifiziert.Die Zielbelegung der KRAS_C12-Stelle lag unter der Behandlung mit 1 μM AMG510 bei nahezu 100 %vor Ort, während die andere Site, KRAS_C80, nicht betroffen war.Diese Daten zeigten die hohe Zielspezifität von AMG510.(Die markierten Cys-Reste sind mit * gekennzeichnet)

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