Nuevas perspectivas terapéuticas para la medicina tradicional: la tecnología ABPP presenta el nuevo objetivo antiinflamatorio EIF2AK2 de Berberine
La medicina tradicional se está revitalizando con nuevas aplicaciones farmacológicas a medida que técnicas avanzadas como el perfil de proteínas basado en actividad (ABPP) arrojan luz sobre mecanismos terapéuticos previamente desconocidos. En este contexto, la tecnología ABPP ha revelado recientemente un nuevo objetivo antiinflamatorio de la berberina, un compuesto extraído de plantas medicinales tradicionales chinas y comúnmente conocido como coptisina o huanglian en China. El descubrimiento destaca a EIF2AK2 como un actor clave en los efectos antiinflamatorios de la berberina, abriendo nuevas vías para su uso en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la inflamación. Este avance subraya el potencial de reutilizar y optimizar las medicinas tradicionales a través de métodos científicos modernos.
La berberina, un alcaloide tradicional con una amplia gama de efectos farmacológicos que incluyen antiinflamatorios, hipoglucemia y protección cardiovascular, ha atraído considerable atención. Sin embargo, sus mecanismos moleculares precisos, particularmente en la supresión de la inflamación, aún no están claros.
Este estudio llena este vacío de conocimiento utilizando la tecnología ABPP para identificar EIF2AK2 como un objetivo crítico de la berberina por su acción antiinflamatoria. Los hallazgos profundizan nuestra comprensión del mecanismo de la berberina y proporcionan una base científica para reposicionar la berberina y desarrollar nuevos fármacos antiinflamatorios dirigidos a EIF2AK2.
El equipo empleó métodos quimioproteómicos avanzados para investigar sistemáticamente las interacciones de la berberina con proteínas intracelulares, confirmando su unión específica a EIF2AK2 y la modulación de su actividad enzimática. Esto influye en las vías de respuesta inflamatoria, inhibiendo eficazmente la progresión de la inflamación. Este importante avance ofrece información sobre el mecanismo antiinflamatorio de la berberina y respalda el desarrollo de nuevas terapias dirigidas a EIF2AK2.
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Ruta de investigación
Proceso experimental
1. La sonda 11b se empleó como herramienta funcional en la investigación proteómica.
Los autores sintetizaron y examinaron nuevas sondas de fotoafinidad BBR que contienen grupos dibenzoilo dentro de macrófagos THP-1 activados por LPS + nigericina. Entre estos, los compuestos 7a y 11b mostraron efectos inhibidores dependientes del tiempo y la dosis sobre la expresión de IL-1β, lo que demuestra una eficacia mejorada en comparación con el compuesto original BBR. A través del análisis de perfil de proteínas basado en actividad (ABPP) y el escaneo de fluorescencia, se confirmó que tanto 7a como 11b se unen efectivamente a sus proteínas objetivo y exhiben inhibición competitiva, lo que indica un mecanismo de acción similar al de BBR. Basado en la observación de que el compuesto 11b exhibía cambios marcados en la intensidad de la fluorescencia dentro del rango de concentración del 2,5% al 25%, particularmente a una concentración de 20 milimolar donde la variación de la señal de fluorescencia era más prominente, se eligió como sonda funcional para estudios de proteómica. . Esta selección se basó en su capacidad de respuesta superior, lo que lo hace adecuado para dilucidar interacciones de proteínas en un entorno proteómico.
Figura 1: Detección y evaluación de sondas BBR.
2. La nueva sonda 11b ha identificado 44 proteínas diana de BBR relacionadas con la inflamación dentro de las células THP-1 y ha revelado que EIF2AK2, eEF1A1, PRDX3 y VPS4B son objetivos directos con interacciones específicas con BBR.
Los autores, a través de una serie de experimentos, emplearon con éxito la nueva sonda 11b para marcar y purificar posibles proteínas diana dentro de las células THP-1. Después de esto, utilizaron análisis LC-MS/MS para identificar 44 proteínas asociadas a la inflamación en el rango de peso molecular de 20 a 80 kDa, entre las cuales se encontró que seis desempeñaban papeles potencialmente críticos en las acciones antiinflamatorias de BBR. En investigaciones adicionales, se confirmó que EIF2AK2, eEF1A1, PRDX3 y VPS4B eran objetivos directos de BBR, y exhibían efectos de inhibición competitiva bajo altas concentraciones de tratamiento con BBR. Este hallazgo reveló la probable existencia de interacciones específicas entre estas proteínas y BBR, aclarando así nuevos conocimientos sobre su interacción con el fármaco durante sus procesos antiinflamatorios.
Figura 2: Captura de proteínas objetivo y análisis funcional.
3. La investigación en biología estructural aclara cómo BBR modula la dimerización de EIF2AK2 para ejercer sus efectos antiinflamatorios a través de interacciones iónicas críticas y la unión del catión-pi.
Los autores emplearon CETSA, SPR y técnicas de acoplamiento molecular para validar las interacciones entre BBR y cuatro proteínas (EIF2AK2, eEF1A1, PRDX3 y VPS4B) en células HEK-293. Los resultados mostraron que BBR aumentó la estabilidad térmica de estas cuatro proteínas, observándose la mayor afinidad por EIF2AK2. Investigaciones adicionales revelaron que la unión de BBR a EIF2AK2 se basa principalmente en pares de iones que involucran a D316 y E367 en la cavidad II, así como en interacciones catión-pi con K291. Este sitio de unión está involucrado en la dimerización de EIF2AK2, lo que sugiere que BBR podría ejercer sus efectos antiinflamatorios al modular la dimerización de EIF2AK2.
Figura 3: Estudios de afinidad entre BBR y sus objetivos potenciales.
4. El papel de BBR en las vías de inflamación y metabolismo de los lípidos se revela ya que inhibe la dimerización y fosforilación de EIF2AK2, lo que demuestra una función fundamental en la regulación del inflamasoma NLRP3, la señalización de NF-kB p65/JNK/SIRT1.
Los experimentos de inmunoprecipitación confirmaron que BBR inhibe la dimerización de EIF2AK2, afectando tanto la autofosforilación de EIF2AK2 como la fosforilación de su sustrato eIF2a, revelando así que BBR regula el inflamasoma NLRP3, NF-kB p65, las vías de señalización JNK y la expresión de SIRT1, desempeñando un papel crucial en las respuestas inflamatorias celulares. mecanismos antiinflamatorios cerebrales (como en la enfermedad de Alzheimer) y estrés del retículo endoplásmico inducido por ácidos grasos. Además, silenciar o sobreexpresar EIF2AK2 alteró significativamente los efectos reguladores de BBR sobre p-JNK y SIRT1, lo que corrobora aún más que BBR actúa mediante la unión a EIF2AK2 para regular los trastornos metabólicos de lípidos relacionados con la inflamación.
Figura 2 Captura de proteínas diana y análisis funcional.
5. Al atacar a EIF2AK2, eEF1A1, PRDX3 y VPS4B, BBR ajusta múltiples vías inflamatorias, y EIF2AK2 desempeña un papel regulador dominante entre estos objetivos.
Para explorar más a fondo esta interacción, los autores establecieron modelos de sobreexpresión y eliminación de las cuatro proteínas, lo que demuestra que BBR modula selectivamente las vías inflamatorias JNK, NF-kB, MAPK y AKT, con EIF2AK2 desempeñando un papel dominante, lo cual fue validado en experimentos in vivo. .
Figura 5: Estudios funcionales de las proteínas diana BBR
6. A través de la focalización específica de EIF2AK2, BBR regula negativamente la secreción in vivo de IL-1β, IL-6, IL-18 y TNF-α; La eliminación del gen EIF2AK2 disminuye su eficacia antiinflamatoria y sus acciones protectoras del hígado.
Luego investigaron si BBR afecta la liberación de IL-1β, IL-6, IL-18 y TNF-α al apuntar a EIF2AK2 in vivo. Para ello, crearon un modelo de ratón con desactivación del gen EIF2AK2 mediante inyección intravenosa de virus adenoasociado (AAV) que porta shEIF2AK2. A ratones de tipo salvaje y knockout para EIF2AK2 se les administró BBR (3 mg/kg) por vía intraperitoneal seguido de una inyección de LPS. Si bien BBR redujo significativamente los niveles de IL-1β, IL-6, IL-18 y TNF-α en el grupo de control, este efecto se atenuó en el grupo knockout de EIF2AK2. El examen histológico mediante tinción con H&E del tejido hepático indicó que el efecto de mejora de la BBR sobre la infiltración de la inflamación hepática se debilitó en ratones knockout para EIF2AK2. Estos hallazgos sugieren que BBR regula potencialmente a la baja la secreción de IL-1β, IL-6, IL-18 y TNF-α al dirigirse a EIF2AK2 y muestra una buena seguridad.
Figura 6: Verificaciones funcionales de EIF2AK2 in vivo.
Este estudio demuestra plenamente las poderosas ventajas de la tecnología ABPP para dilucidar los complejos mecanismos de moléculas bioactivas como la berberina, impulsando el avance de la investigación moderna sobre medicamentos tradicionales. Al descubrir nuevos objetivos y mecanismos de acción para el antiguo fármaco berberina, no sólo enriquece nuestra comprensión de las funciones biológicas de las medicinas tradicionales, sino que también abre nuevas perspectivas y posibilidades para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la inflamación. Este resultado presagia que, con el apoyo de técnicas científicas modernas como la ABPP, los medicamentos más tradicionales serán reutilizados mediante la identificación de sus objetivos y mecanismos específicos, haciendo contribuciones significativas a los esfuerzos de salud humana.
Referencia:https://doi.org/10.1016/j.apsb.2022.12.009.