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Perfil quimioproteómico competitivo de dianas proteicas para fármacos covalentes de moléculas pequeñas
Características técnicas de la plataforma
Al igual que con los fármacos no covalentes, la estrategia de extracción directa mediante el uso de sondas químicas funcionalizadas con grupos informadores también se ha demostrado con éxito para fármacos covalentes de moléculas pequeñas. Sin embargo, cabe señalar que algunos fármacos covalentes son intolerantes a las modificaciones químicas debido a la pérdida de bioactividad o a la inaccesibilidad sintética. Además, el enlace covalente formado suele ser inestable durante la detección de MS.
La estrategia quimioproteómica competitiva es una alternativa ideal, que utiliza una sonda universal basada en actividad para el etiquetado de proteínas. Se han desarrollado sondas químicas específicas para reaccionar con residuos de cisteína, lisina, serina e histidina. En principio, una vez ocupado por una pequeña molécula covalente, la sonda no puede marcar el residuo de aminoácido. Como resultado, los objetivos ON y OFF podrían identificarse de manera integral mediante esta estrategia competitiva con la resolución de aminoácidos.
Flujo de trabajo
La plataforma sigue un flujo de trabajo estructurado, que comienza con el etiquetado de células vivas con moléculas covalentes, seguido de pasos que incluyen la extracción del proteoma marcado, el etiquetado con sonda química, la ligadura bioortogonal, el enriquecimiento basado en estreptavidina, la digestión con proteasas, el etiquetado isotópico y la detección final por espectrometría de masas.
Estudio de caso
Objetivo del proyecto
AMG510, desarrollado por Amgen, es el primer fármaco aprobado dirigido a la mutación KRAS-G12C en tumores. El objetivo del proyecto era perfilar las dianas activas y desactivadas de AMG510 en células NCI-H358 con la mutación KRAS-G12C.
Método experimental
Se utilizó DIA-ABPP, una de las plataformas tecnológicas centrales de ChomiX, para analizar la ocupación objetivo en el nivel del proteoma.
Visualización de datos
Se cuantificaron un total de 16992 sitios Cys de 5768 proteínas en células NCI-H358. La ocupación objetivo del sitio KRAS_C12 fue cercana al 100% bajo el tratamiento de AMG510 1 μMin situ, mientras que el otro sitio, KRAS_C80, no se vio afectado. Estos datos demostraron la alta especificidad objetivo de AMG510. (Los residuos de Cys etiquetados se indican con *)
