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Profilazione chemioproteomica competitiva di bersagli proteici per farmaci covalenti a piccole molecole
Caratteristiche tecniche della piattaforma
Similmente ai farmaci non covalenti, la strategia di pulldown diretto utilizzando sonde chimiche funzionalizzate con gruppi reporter è stata dimostrata con successo anche per i farmaci covalenti a piccole molecole. Tuttavia, vale la pena notare che alcuni farmaci covalenti sono intolleranti alle modifiche chimiche dovute alla perdita di bioattività o all’inaccessibilità sintetica. Inoltre, il legame covalente formato è solitamente instabile durante il rilevamento della MS.
La strategia chemioproteomica competitiva è un'alternativa ideale, che utilizza una sonda universale basata sull'attività per l'etichettatura delle proteine. Sono state sviluppate sonde chimiche specifiche per reagire con residui di cisteina, lisina, serina e istidina. In linea di principio, una volta occupato da una piccola molecola covalente, il residuo amminoacidico non può essere marcato dalla sonda. Di conseguenza, gli obiettivi ON e OFF potrebbero essere identificati in modo completo da questa strategia competitiva con la risoluzione dell'amminoacido.
Flusso di lavoro
La piattaforma segue un flusso di lavoro strutturato, iniziando con l'etichettatura delle cellule viventi con molecole covalenti, seguita da passaggi che includono l'estrazione del proteoma etichettato, l'etichettatura della sonda chimica, la legatura bioortogonale, l'arricchimento a base di streptavidina, la digestione della proteasi, l'etichettatura isotopica e il rilevamento finale tramite spettrometria di massa.
Caso di studio
Scopo del progetto
AMG510, sviluppato da Amgen, è il primo farmaco approvato che mira alla mutazione KRAS-G12C nei tumori. Lo scopo del progetto era profilare i bersagli on e off di AMG510 nelle cellule NCI-H358 con la mutazione KRAS-G12C.
Metodo sperimentale
DIA-ABPP, una delle piattaforme tecnologiche principali di ChomiX, è stata utilizzata per analizzare l'occupazione del target a livello del proteoma.
Visualizzazione dei dati
Un totale di 16992 siti Cys da 5768 proteine sono stati quantificati nelle cellule NCI-H358. L'occupazione target del sito KRAS_C12 era vicina al 100% sotto il trattamento di 1 μM AMG510in situ, mentre l'altro sito, KRAS_C80, non è stato interessato. Questi dati hanno dimostrato l’elevata specificità target di AMG510. (I residui Cys etichettati sono indicati con *)
