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Profilazione chemioproteomica di bersagli proteici per farmaci a piccole molecole non covalenti
Caratteristiche tecniche della piattaforma
I farmaci a piccole molecole svolgono un ruolo importante nel campo della ricerca e sviluppo farmaceutico. Gli attuali farmaci approvati dalla FDA prendono di mira un totale di 812 proteine umane distinte. Tra i farmaci diretti contro i target sopra menzionati, l'84% sono farmaci a piccole molecole. Inoltre, solo 639 di queste proteine sono state prese di mira con farmaci a piccole molecole. L'interazione tra il farmaco a piccole molecole e il bersaglio proteico comprende modalità non covalenti e covalenti, e la prima è attualmente dominante.
Le interazioni non covalenti, come i legami idrogeno e l'impilamento π-π, possono essere interrotte a causa della denaturazione delle proteine. Per affrontare questa sfida, la nostra piattaforma utilizza l'etichettatura per fotoaffinità, una tecnica consolidata per attaccare con precisione "etichette chimiche" al sito attivo di una proteina. Inoltre, la nostra innovativa strategia di reticolazione chimica in situ trasforma le interazioni proteiche transitorie non covalenti in legami chimici covalenti e permanenti. Utilizzando una sonda chimica funzionalizzata sia con fotoaffinità che con porzioni bioortogonali, la piattaforma chemioproteomica di ChomiX ha dimostrato la sua efficacia nell'individuare con successo bersagli proteici all'interno di lisati cellulari, tessuti e cellule viventi. Lo spettro di farmaci bioattivi a piccole molecole applicati nella piattaforma comprende una varietà di composti, inclusi metaboliti endogeni, prodotti naturali e molecole sintetiche non covalenti.
Flusso di lavoro
La piattaforma segue un flusso di lavoro strutturato, iniziando con l'etichettatura delle cellule viventi utilizzando una sonda di fotoaffinità derivata da molecole non covalenti. Le fasi successive includono l'estrazione di proteomi marcati, la legatura bioortogonale, l'arricchimento a base di streptavidina, la digestione delle proteasi, l'etichettatura isotopica e, infine, il rilevamento mediante spettrometria di massa.
Caso di studio
Scopo del progetto
Il composto A ha mostrato una buona attività antiproliferazione nel test di vitalità cellulare. Per caratterizzare i target proteici è stata utilizzata la piattaforma chemioproteomica.
Metodo sperimentale
La sonda chimica per fotoaffinità, la sonda A, è stata progettata e sintetizzata sulla base dei dati SAR del composto A. La sonda A ha mostrato anche un'attività antiproliferazione simile nella linea cellulare tumorale. Sono stati eseguiti esperimenti basati su gel e MS. I dati MS sono stati analizzati per la delucidazione del MOA.
Visualizzazione dei dati
I risultati della fluorescenza su gel hanno mostrato che la sonda A poteva etichettare efficacemente le proteine e il segnale di marcatura poteva essere significativamente competitivo dal composto A. Collettivamente, questi dati indicavano che la sonda A poteva essere utilizzata come strumento di sonda chimica per la successiva scoperta del target da allora potrebbe legare le stesse proteine del composto A.
Il grafico del vulcano ha mostrato che 114 proteine (evidenziazione rossa) sono state arricchite in modo significativo dalla sonda A nel gruppo Sonda A rispetto a DMSO (diretto) e 38 proteine (evidenziazione rossa) sono state competite in modo significativo dal composto A nel gruppo Sonda A rispetto a (A+Sonda A ) Gruppo (Concorrenza). I diagrammi di Venn hanno mostrato che 32 proteine sovrapposte potrebbero essere potenziali bersagli di legame del composto A con elevata confidenza.（n = 3, rapporto ≥2,valore p ≤ 0,05）
