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Nuove prospettive terapeutiche per la medicina tradizionale: la tecnologia ABPP svela il nuovo bersaglio antinfiammatorio della berberina EIF2AK2
La medicina tradizionale viene rivitalizzata con nuove applicazioni farmacologiche poiché tecniche avanzate come l’Activity-Based Protein Profiling (ABPP) fanno luce su meccanismi terapeutici precedentemente sconosciuti. In questo contesto, la tecnologia ABPP ha recentemente rivelato un nuovo bersaglio antinfiammatorio della berberina, un composto estratto dalle piante medicinali tradizionali cinesi e comunemente noto in Cina come Coptisina o Huanglian. La scoperta evidenzia il ruolo chiave dell'EIF2AK2 negli effetti antinfiammatori della berberina, aprendo nuove strade per il suo utilizzo nel trattamento delle malattie legate all'infiammazione. Questa svolta sottolinea il potenziale di riutilizzo e ottimizzazione delle medicine tradizionali attraverso metodi scientifici moderni.
La berberina, un alcaloide tradizionale con effetti farmacologici ad ampio raggio tra cui antinfiammatori, ipoglicemia e protezione cardiovascolare, ha attirato notevole attenzione. Tuttavia, i suoi precisi meccanismi molecolari, in particolare nella soppressione dell’infiammazione, rimangono poco chiari.
Questo studio colma questa lacuna di conoscenza utilizzando la tecnologia ABPP per identificare EIF2AK2 come un bersaglio critico utilizzato dalla berberina per la sua azione antinfiammatoria. I risultati approfondiscono la nostra comprensione del meccanismo della berberina e forniscono una base scientifica per riposizionare la berberina e sviluppare nuovi farmaci antinfiammatori mirati a EIF2AK2.
Il team ha utilizzato metodi chemioproteomici avanzati per studiare sistematicamente le interazioni della berberina con le proteine intracellulari, confermando il suo legame specifico con EIF2AK2 e la modulazione della sua attività enzimatica. Ciò influenza i percorsi di risposta infiammatoria, inibendo efficacemente la progressione dell’infiammazione. Questa significativa innovazione offre approfondimenti sul meccanismo antinfiammatorio della berberina e supporta lo sviluppo di nuove terapie mirate a EIF2AK2.
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Itinerario di ricerca
Processo sperimentale
1. La sonda 11b è stata utilizzata come strumento funzionale nella ricerca sulla proteomica.
Gli autori hanno sintetizzato e selezionato nuove sonde di fotoaffinità BBR contenenti gruppi dibenzoilici all'interno di macrofagi THP-1 attivati da LPS + nigericina. Tra questi, i composti 7a e 11b hanno mostrato effetti inibitori tempo e dose-dipendenti sull'espressione di IL-1β, dimostrando una maggiore efficacia rispetto al composto genitore BBR. Attraverso l'analisi ABPP (Activity-Based Protein Profiling) e la scansione a fluorescenza, è stato dimostrato che sia 7a che 11b si legano efficacemente alle proteine bersaglio e mostrano un'inibizione competitiva, indicando così un meccanismo d'azione simile a quello di BBR. Sulla base dell'osservazione che il composto 11b mostrava marcati cambiamenti nell'intensità della fluorescenza nell'intervallo di concentrazione dal 2,5% al 25%, in particolare a una concentrazione di 20 millimolari dove la variazione del segnale di fluorescenza era più evidente, è stato scelto come sonda funzionale per studi di proteomica . Questa selezione è stata motivata dalla sua reattività superiore, che lo rende adatto a chiarire le interazioni proteiche in un contesto proteomico.
Figura 1: Screening e valutazione delle sonde BBR.
2. La nuova sonda 11b ha identificato 44 proteine bersaglio di BBR correlate all'infiammazione all'interno delle cellule THP-1 e ha rivelato EIF2AK2, eEF1A1, PRDX3 e VPS4B come bersagli diretti con interazioni specifiche con BBR.
Gli autori, attraverso una serie di esperimenti, hanno utilizzato con successo la nuova sonda 11b per marcare e purificare potenziali proteine bersaglio all'interno delle cellule THP-1. Successivamente, hanno utilizzato l’analisi LC-MS/MS per identificare 44 proteine associate all’infiammazione nell’intervallo di peso molecolare compreso tra 20 e 80 kDa, tra le quali sei hanno scoperto di svolgere un ruolo potenzialmente critico nelle azioni antinfiammatorie di BBR. In ulteriori indagini, EIF2AK2, eEF1A1, PRDX3 e VPS4B sono stati confermati come bersagli diretti di BBR, mostrando effetti di inibizione competitiva ad alte concentrazioni di trattamento con BBR. Questa scoperta ha rivelato la probabile esistenza di interazioni specifiche tra queste proteine e BBR, chiarendo così nuove informazioni sul loro coinvolgimento con il farmaco durante i suoi processi antinfiammatori.
Figura 2: Cattura delle proteine bersaglio e analisi funzionale.
3. La ricerca sulla biologia strutturale chiarisce come BBR modula la dimerizzazione di EIF2AK2 per esercitare i suoi effetti antinfiammatori attraverso interazioni ioniche critiche e legame catione-pi.
Gli autori hanno utilizzato tecniche CETSA, SPR e docking molecolare per convalidare le interazioni tra BBR e quattro proteine (EIF2AK2, eEF1A1, PRDX3 e VPS4B) nelle cellule HEK-293. I risultati hanno mostrato che BBR ha aumentato la stabilità termica di queste quattro proteine, con l'affinità più forte osservata per EIF2AK2. Ulteriori indagini hanno rivelato che il legame di BBR a EIF2AK2 si basa principalmente su coppie ioniche che coinvolgono D316 ed E367 nella cavità II, nonché sulle interazioni catione-pi con K291. Questo sito di legame è coinvolto nella dimerizzazione di EIF2AK2, suggerendo che BBR potrebbe esercitare i suoi effetti antinfiammatori modulando la dimerizzazione di EIF2AK2.
Figura 3: Studi di affinità tra BBR e i suoi potenziali bersagli.
4. Il ruolo di BBR nell'infiammazione e nelle vie del metabolismo lipidico viene rivelato poiché inibisce la dimerizzazione e la fosforilazione di EIF2AK2, dimostrando così una funzione fondamentale nella regolazione dell'inflammasoma NLRP3, segnalazione NF-kB p65/JNK/SIRT1.
Esperimenti di immunoprecipitazione hanno confermato che BBR inibisce la dimerizzazione di EIF2AK2, influenzando sia l'autofosforilazione di EIF2AK2 che la fosforilazione del suo substrato eIF2a, rivelando così che BBR regola l'inflammasoma NLRP3, NF-kB p65, le vie di segnalazione JNK e l'espressione SIRT1, giocando un ruolo cruciale nelle risposte infiammatorie cellulari, meccanismi antinfiammatori cerebrali (come nel morbo di Alzheimer) e stress del reticolo endoplasmatico indotto dagli acidi grassi. Inoltre, il silenziamento o la sovraespressione di EIF2AK2 ha alterato in modo significativo gli effetti regolatori di BBR su p-JNK e SIRT1, confermando ulteriormente che BBR agisce legandosi a EIF2AK2 per regolare i disturbi metabolici dei lipidi legati all'infiammazione.
Figura 2 Cattura delle proteine target e analisi funzionale.
5. Prendendo di mira EIF2AK2, eEF1A1, PRDX3 e VPS4B, BBR regola molteplici percorsi infiammatori, con EIF2AK2 che gioca un ruolo regolatore dominante tra questi bersagli.
Per esplorare ulteriormente questa interazione, gli autori hanno stabilito modelli di sovraespressione e knockdown delle quattro proteine, dimostrando che BBR modula selettivamente i percorsi infiammatori JNK, NF-kB, MAPK e AKT, con EIF2AK2 che gioca un ruolo dominante, che è stato convalidato in esperimenti in vivo .
Figura 5: Studi funzionali delle proteine bersaglio BBR
6. Attraverso il targeting specifico di EIF2AK2, BBR sottoregola la secrezione in vivo di IL-1β, IL-6, IL-18 e TNF-α; il knockdown del gene EIF2AK2 ne diminuisce l'efficacia antinfiammatoria e l'azione protettiva del fegato.
Hanno quindi studiato se BBR influisce sul rilascio di IL-1β, IL-6, IL-18 e TNF-α prendendo di mira EIF2AK2 in vivo. Per fare ciò, hanno creato un modello murino knockout del gene EIF2AK2 utilizzando l’iniezione endovenosa del virus adeno-associato (AAV) portatore di shEIF2AK2. Ai topi wild-type e knockout per EIF2AK2 è stato somministrato BBR (3 mg/kg) per via intraperitoneale seguito da iniezione di LPS. Mentre BBR ha ridotto significativamente i livelli di IL-1β, IL-6, IL-18 e TNF-α nel gruppo di controllo, questo effetto è stato attenuato nel gruppo knockout per EIF2AK2. L'esame istologico tramite colorazione H&E del tessuto epatico ha indicato che l'effetto migliorativo del BBR sull'infiltrazione dell'infiammazione epatica era indebolito nei topi knockout per EIF2AK2. Questi risultati suggeriscono che BBR sottoregola potenzialmente la secrezione di IL-1β, IL-6, IL-18 e TNF-α attraverso il targeting di EIF2AK2 e mostra una buona sicurezza.
Figura 6: verifiche funzionali EIF2AK2 in vivo.
Questo studio dimostra pienamente i potenti vantaggi della tecnologia ABPP nel chiarire i complessi meccanismi delle molecole bioattive come la berberina, promuovendo il progresso della ricerca moderna sui farmaci tradizionali. Scoprendo nuovi bersagli e meccanismi d’azione per il vecchio farmaco berberina, non solo arricchisce la nostra comprensione delle funzioni biologiche delle medicine tradizionali, ma apre anche nuove prospettive e possibilità per il trattamento delle malattie legate all’infiammazione. Questo risultato prefigura che, con il supporto di moderne tecniche scientifiche come l’ABPP, i farmaci più tradizionali verranno riproposti attraverso l’identificazione dei loro obiettivi e meccanismi specifici, apportando un contributo significativo agli sforzi per la salute umana.
Riferimento:https://doi.org/10.1016/j.apsb.2022.12.009.