【国家重点プロジェクト資金】金属結合タンパク質の解明：METAL-TPPのブレークスルーと創薬イノベーション
金属結合タンパク質は、金属イオンと安定した複合体を形成する重要な成分であり、細胞シグナル伝達、生化学反応の触媒、金属イオンの恒常性維持など、生体のさまざまな重要な機能を担っています。彼らの調節不全は、がん、神経障害、代謝性疾患などの病気に関連しています。疾患の発症におけるそれらの役割を理解することは、診断と治療にとって極めて重要です。さらに、多くの医薬品が金属結合タンパク質と相互作用して治療効果を発揮するため、金属結合タンパク質は医薬品開発における重要な標的となっています。この研究では、研究者らは最先端の化学プロテオミクス手法である METAL-TPP を導入しました。熱安定性定量的プロテオーム解析 (TPP) と金属結合タンパク質の同定を組み合わせた METAL-TPP により、金属結合タンパク質の効率的かつ正確な検出が可能になります。特に、さまざまな金属キレート剤を使用してタンパク質の熱安定性を制御し、純粋なタンパク質や細胞溶解物の正確な同定を容易にします。この革新的なアプローチは、金属結合タンパク質の機能とメカニズムに関する新たな洞察を提供し、生物学的研究、疾患の理解、および医薬品開発を支援します。 Keloxi Biology は、医薬品の研究開発における高度な ABPP、TPP、およびその他の技術サービスを提供し、研究者による薬物メカニズムの探索と新薬開発プロセスの推進をサポートします。
実験プロセス
1. METAL-TPP を使用して、17 個の潜在的な金属結合タンパク質が同定されました。
研究者らは当初、純粋なタンパク質と細胞溶解物に対する EDTA を使用した広域金属キレート化の有効性を評価しました。彼らは、METAL-TPP が金属結合タンパク質の熱安定性の低下を効果的に検出することを観察しました。その後、METAL-TPPを用いてヒト由来タンパク質の系統的な解析を行ったところ、熱安定性が低下しているタンパク質が125個特定された。これらのうち、102 個は以前から知られていた金属結合タンパク質でした。さらに、事前に機能的注釈が付けられていない 17 個の潜在的な金属結合タンパク質が明らかになり、金属結合タンパク質の役割についての新たな洞察が得られました。
2. 潜在的な金属結合タンパク質 GFPT2 に対する亜鉛イオンの影響。
これら 17 種類の金属結合タンパク質の可能性の中から、研究者らはタンパク質 GFPT2 について詳細な生化学的検証を行うことを選択しました。 GFPT1/2 は、ヘキソース生合成経路における最初の律速酵素として機能し、UDP-GlcNAc と呼ばれる物質の生成を助けます。研究者らは、亜鉛イオンがGFPT2と相互作用し、その活性を阻害することを細胞レベルで確認した。さらに、彼らは、亜鉛イオンの存在がUDP-GlcNAcレベルの大幅な低下につながることを観察し、亜鉛イオンがGFPT2の活性を阻害することによってヘキソース生合成経路を調節していることを示した。興味深いことに、亜鉛イオンは GFPT2 と GFPT1 の活性の阻害において異なる選択性を示し、新規な調節機構の存在を示唆しています。
3. GFPT2 および GLMS 酵素の活性に対する亜鉛イオンの分子機構を解明する。
研究者らは大腸菌からGFPT2タンパク質の相同体を単離し、一連の生化学実験と結晶構造解析を進めた。この発見により、GLMS タンパク質には亜鉛イオンと結合する能力があり、注目すべきことに、この結合は基質結合領域の近くで起こることが明らかになりました。これは、亜鉛イオンが GLMS と GFPT2 の活性部位での結合を巡って競合するか、または活性部位と配位結合を形成することで両方の酵素の活性を妨げる可能性があるという潜在的なシナリオを示唆しています。
4.金属キレート剤 TPEN は亜鉛イオン結合タンパク質を特異的に認識します。
最後に、研究者らは、金属キレート剤 TPEN を使用して、METAL-TPP の能力を拡張し、ヒトタンパク質内の金属結合タンパク質を同定しました。実験の結果、熱安定性が低下した150種類のタンパク質のうち、110種類（73％）が既知の金属結合タンパク質であることが明らかになり、TPENはEDTAと同様に金属結合タンパク質を特異的に認識できることが示されました。これらのうち、既知の金属結合タンパク質の 95 (86%) が亜鉛イオン結合タンパク質であったのに対し、EDTA によって熱安定性が低下したタンパク質のうち亜鉛イオン結合タンパク質であったのは 41% のみであり、TPEN が亜鉛イオンの同定を優先していることが示唆されています。 -結合タンパク質。
同定された40の潜在的な金属結合タンパク質のうち、著者らは予備的な生化学的検証のために1つの標的タンパク質GPATCH11を選択し、このタンパク質が亜鉛イオン結合タンパク質であることを発見した。
5. METAL-TPP における 2 つの金属キレート剤の認識能力の比較。
研究者らはまた、METAL-TPP プロテオミクス データで熱安定性が低下したタンパク質を特定する 2 つの金属キレート剤、TPEN と EDTA の能力を比較しました。彼らは、両キレーターによって同定された37個のタンパク質のうち、27個は亜鉛に結合することが知られており、5個は他の金属に結合することが知られており、5個はこれまで金属結合タンパク質として注釈が付けられていなかったことが判明した。あるキレート剤下では熱安定性が低下し、もう一方のキレート剤下では熱安定性が変わらないか増加したタンパク質について、研究者らは、METAL-TPPによる識別範囲の違いについて考えられる2つの理由を示唆した。まず、各キレート剤は一部のタンパク質において結合リガンドとして機能し、タンパク質の安定性を高め、金属結合によって引き起こされる不安定化効果を打ち消す可能性があります。第二に、分子構造が異なるため、2 つのキレート剤は水に対する溶解度も大きく異なります。したがって、将来の METAL-TPP 研究は、メタロプロテオームの範囲をより包括的に調査するために、ユニークな分子構造を持つ他のキレーターを使用して実行できる可能性があります。
全体として、この研究は、金属結合プロテオミクス研究を行うための強力なツールとして機能する新しい方法 METAL-TPP を導入しました。このアプローチを通じて、研究者らは金属結合タンパク質を体系的に同定し、生物学的機能と病因におけるそれらの役割を解明しました。この取り組みは重要なデータベースを確立するだけでなく、金属結合タンパク質の生化学的機能と創薬の可能性を理解するための貴重な洞察を提供し、それによって関連分野のさらなる研究を促進します。