ABPP 분석을 통해 단백질-대사산물 상호작용을 통한 이타콘산의 새로운 항염증 메커니즘이 밝혀졌습니다.
염증과 면역 조절에 중요한 내인성 대사물질인 이타코네이트는 초믹스바이오텍팀의 공동 논문에서 그 역할이 밝혀졌습니다. 이 연구는 혁신적으로 ABPP 기술을 사용하여 이타코네이트가 주요 해당효소에 있는 시스테인 잔기의 S-글리코실화를 변형하여 세포 대사에 영향을 미친다는 사실을 밝혔습니다. 연구자들은 단백질-이타코네이트 상호작용을 매핑하여 이타코네이트가 해당과정 경로에서 여러 효소에 직접 결합하고 조절하여 그 속도와 방향에 영향을 미친다는 사실을 발견했습니다. 이 연구는 질병 관련 염증 중 대사 조절 메커니즘에 대한 지식을 발전시키고 작은 분자가 단백질 기능을 조절하는 방법을 탐구하는 ABPP의 강점을 보여줍니다. 화학 단백질체학 분야의 선두주자인 Corolus BioScience는 고객이 유사한 대사 조절 메커니즘을 발견할 수 있도록 프로브 설계, 시료 처리, 고처리량 스크리닝 및 데이터 분석을 포함한 포괄적인 솔루션을 제공합니다.
1. 1-OH-Az 프로브를 사용한 이타코네이트 변형 감지
본 연구에서 저자는 이타코네이트 표적화 시스테인 잔기를 조사하기 위해 고급 프로파일링 기술을 사용했습니다. 그들은 처음에 겔 전기영동을 통해 프로브 1-OH-Az를 평가하고 IA-알킨을 사용하여 경쟁 실험을 수행했습니다. 질량 분석법 검증을 통해 1-OH-Az는 이전에 DrugBank에서 리간드 결합 단백질로 기록되지 않은 새로 확인된 단백질의 87%를 사용하여 시스테인 부위를 선택적으로 표시하는 것으로 확인되었습니다. 이러한 단백질의 다양한 기능과 질병 관련성을 고려할 때 1-OH-Az 프로브를 사용하여 활성 시스테인을 새로운 치료법의 잠재적인 약물 표적으로 식별할 수 있습니다.
그림 1: 이타코네이트 변형을 검출하기 위한 효율적이고 독특한 시스테인 분석 프로브인 1-OH-Az
2. 정량적 프로테오믹스 기술을 사용하여 이타코네이트 변형 부위 식별
연구진은 1-OH-Az 프로브를 사용하여 이타코네이트에 의해 변형된 시스테인 잔기를 정량화하기 위해 isoTOP-ABPP 실험을 수행했습니다. 용해물 전처리 후, 동위원소 표지된 링커 보조 정량적 단백질체학을 활용하여 다양한 농도의 이타코네이트가 미치는 영향을 분석하고 특정 표적을 정확히 찾아냈습니다. 또한 두 가지 농도의 IA-알킨을 사용하여 비교 실험을 수행했는데, 이는 더 넓은 활동과 적용 범위를 보여 주지만 65개와 50개의 효과적인 경쟁 사이트만 인식했습니다. 특히, 1-OH-Az는 공동 정량화된 시스테인 중에서 훨씬 더 높은 경쟁 우위를 보여주었습니다.
그림 2: 1-OH-Az가 포함된 경쟁 isoTOP-ABPP를 활용한 이타코네이트 변형 시스테인의 화학적 단백질체학 분석
3. 이타코네이트는 주요 해당효소를 변형하고 억제합니다.
질량 분석 결과 이타코네이트는 ALDOA, GAPDH, LDHA라는 세 가지 주요 해당 효소를 변형시키는 것으로 나타났습니다. ALDOA의 Cys73 및 Cys339에 대한 내인성 이타코네이트 변형은 LPS로 자극된 Raw264.7 세포 내에서 확인되었습니다. 그들의 근접성으로 인해 저자는 그러한 변형이 알돌라제 활성에 영향을 미칠 수 있다고 추측했습니다. 실제로, 1mM 이타코네이트로 처리하면 단백질 발현에 영향을 주지 않고 ALDOA 효소 활성이 감소했습니다. 더욱이, isoTOP-ABPP 분석은 LDHA의 Cys84와 GAPDH의 Cys245도 이타코네이트 변형의 표적임을 보여주었습니다.
그림 3: Itaconate는 ALDOA 기능을 수정 및 손상시킬 수 있습니다.
4. Itaconate는 주로 ALDOA를 표적으로 하여 해당과정을 억제합니다.
염증성 대식세포 해당작용에서 ITAC의 조절 역할을 평가하기 위해 저자는 LPS 자극 전후에 Raw264.7 세포에서 포도당 소비와 젖산염 생산을 모니터링하여 ITAC가 두 가지를 모두 크게 감소시켜 해당 기능의 억제를 나타냄을 입증했습니다. ALDOA 및 후속 해당작용 억제에 대한 ITAC의 효과를 검증하기 위해 그들은 RNAi를 사용하여 내인성 ALDOA를 녹다운시키고 Raw264.7 세포에서 WT 또는 이중 돌연변이(C73S/C339S) ALDOA를 과발현했습니다. 예상한 대로, ALDOA의 녹다운은 포도당 소비와 젖산염 생산을 감소시켜 세포가 ITAC 치료에 둔감하게 만듭니다. WT 또는 돌연변이 ALDOA의 재도입은 치료되지 않은 세포에서 대사 수준을 회복시켰습니다. 그러나 돌연변이 ALDOA를 과발현하는 세포는 WT에 비해 해당과정 억제에 대한 민감도가 감소한 것으로 나타났습니다. 해당과정 상태와 정렬된 알돌라제 활성에 대한 효소 분석.
그림 4: 이타코네이트는 ALDOA 수정을 통해 해당과정 경로를 변경합니다.
5. ALDOA의 억제는 항염증 반응에 기여합니다
이러한 발견은 ITAC가 ALDOA의 시스테인 잔기 Cys73 및 Cys339를 변형함으로써 해당 경로 활성을 억제한다는 것을 보여주었습니다. 저자들은 또한 GAPDH에 대한 시스테인 변형과 해당작용 억제를 통한 디메틸 푸마르산염의 알려진 항염증 작용으로부터 ITAC가 항염증 효과를 발휘하기 위해 해당작용을 방해하도록 유사하게 피드백할 수 있다고 추론했습니다. ALDOA의 녹다운은 LPS 자극 시 IL-1β 분비를 크게 감소시켰으며, 이는 해당작용을 통한 염증 조절에 ALDOA가 관여함을 시사합니다. 보충된 피루베이트를 사용하여 ALDOA 녹다운의 항염증 효과를 부분적으로 역전시키는 것은 염증 반응에서 LDHA의 역할이 제한적임을 나타냅니다.
그림 5: 이타코네이트의 항염증 작용은 ALDOA 억제를 통해 매개되어 해당과정을 중단시킵니다.
요약하면, 이 논문은 S-글리코실화 기반 시스테인 프로파일링 기술과 ABPP 방법론을 효과적으로 활용하여 이타코네이트와 관련 단백질 간의 상호 작용 네트워크를 구축했습니다. 이는 이타코네이트가 해당 경로를 제어하기 위해 단백질의 시스테인 잔기를 특이적으로 변형함으로써 중요한 대사 조절자 역할을 한다는 것을 설득력 있게 보여줍니다. 이 연구는 새로운 대사 조절제로서 이타코네이트의 작용 메커니즘을 밝힐 뿐만 아니라 작은 대사 산물이 단백질과 상호 작용하여 핵심 대사 경로를 조절하는 방법에 대한 강력한 증거를 제공합니다.
ABPP 외에도 소분자 대사산물과 단백질 간의 상호작용을 연구하는 다른 방법에는 다음이 포함되지만 이에 국한되지는 않습니다.
1. 선호도 강화(풀다운)천연 화합물을 세포 용해물과 함께 배양하는 비오티닐화된 프로브로 변환한 후 스트렙타비딘 매개 농축 및 비오틴 프로브에 결합하는 단백질 표적을 분리하는 기술입니다.
2.제한된 단백질 분해 질량 분석법(LiP-MS)단백질 친화도 기반 표적발견 기술입니다. 약물이나 작은 분자와 같은 특정 리간드가 특정 단백질에 결합하면 형태 변화나 입체 장애를 유발하여 결합되지 않은 단백질과 비교하여 차별적인 절단 부위를 초래합니다. 질량 분석법을 사용하여 이러한 차이를 감지함으로써 이 방법은 세포 내 약물-단백질 상호 작용을 식별하고 약물의 분자 표적을 결정할 수 있습니다.
3.세포 열 이동 분석(CETSA)처음에는 항암 약물 표적 연구를 돕기 위해 개발되었으며 손상되지 않은 세포에서 약물 표적 참여를 연구하기 위해 최초로 널리 사용되는 라벨 없는 방법 중 하나입니다. CETSA는 주로 표적 단백질에 결합하면 화합물이 열 안정성을 증가시키는 원리에 의존합니다. 다양한 온도 구배에서 화합물 및 해당 컨트롤과 함께 샘플을 배양한 후 리간드에 결합된 단백질은 가열 후에도 접힌 상태로 비교적 안정적인 상태를 유지하는 반면, 결합되지 않은 단백질은 변성으로 인해 펼쳐지고 침전됩니다. 용융 곡선을 기반으로 하는 면역블로팅 또는 질량 분석 기반 접근법을 통한 가용성 단백질 열안정성의 후속 분석은 화합물과 세포내 단백질 간의 상호 작용을 확인합니다.
4. 친화성 크로마토그래피표적 대사산물을 고상 매트릭스에 결합시켜 상호작용하는 단백질 복합체를 포착하는 과정이 포함됩니다. 그런 다음 포획된 단백질은 질량 분석법과 같은 기술을 사용하여 식별됩니다.
5.표면 플라즈몬 공명(SPR)작은 분자와 단백질 사이의 상호 작용과 관련된 운동 매개변수를 라벨 없이 실시간으로 측정하는 데 사용됩니다.
6. 단백질 결정학소분자 리간드와 복합체를 이루는 단백질의 3차원 구조를 밝혀 결합 부위와 작용 메커니즘에 대한 직관적인 통찰력을 제공합니다. 이러한 구조를 해결함으로써 연구자들은 작은 분자가 단백질 표적과 어떻게 상호 작용하는지 직접 시각화할 수 있습니다.