[국가 핵심 프로젝트 자금] 금속 결합 단백질 풀기: METAL-TPP 혁신 및 약물 발견 혁신
금속 결합 단백질은 금속 이온과 안정적인 복합체를 형성하는 중요한 구성 요소로, 세포 신호 전달, 생화학 반응 촉매, 금속 이온 항상성 유지 등 살아있는 유기체에서 다양한 필수 기능을 수행합니다. 이들의 조절 장애는 암, 신경 장애, 대사 질환과 같은 질병과 관련이 있습니다. 질병 발병기전에서 이들의 역할을 이해하는 것은 진단과 치료에 중추적인 역할을 합니다. 더욱이, 금속 결합 단백질은 많은 약물이 치료 효과를 발휘하기 위해 금속 결합 단백질과 상호작용하기 때문에 약물 개발에서 중요한 표적입니다. 이번 연구에서 연구진은 최첨단 화학적 단백질체학 방법인 METAL-TPP를 도입했다. METAL-TPP는 열안정성 정량 단백질체학 분석(TPP)과 금속 결합 단백질 식별을 결합하여 금속 결합 단백질을 효율적이고 정확하게 검출할 수 있습니다. 특히, 다양한 금속 킬레이트제를 사용하여 단백질의 열안정성을 조절하여 순수 단백질과 세포 용해물에서 정확한 식별을 용이하게 합니다. 이 혁신적인 접근 방식은 금속 결합 단백질 기능과 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 제공하여 생물학적 연구, 질병 이해 및 약물 개발을 지원합니다. Keloxi Biology는 제약 R&D에서 고급 ABPP, TPP 및 기타 기술 서비스를 제공하여 연구자들이 약물 메커니즘을 탐구하고 신약 개발 프로세스를 발전시킬 수 있도록 지원합니다.
실험 과정
1. METAL-TPP를 사용하여 17개의 잠재적인 금속 결합 단백질이 확인되었습니다.
처음에 연구자들은 순수 단백질과 세포 용해물에 대해 EDTA를 사용한 광범위한 금속 킬레이트화의 효능을 평가했습니다. 그들은 METAL-TPP가 금속 결합 단백질의 열 안정성 감소를 효과적으로 감지한다는 것을 관찰했습니다. 그 후, METAL-TPP를 사용하여 인간 유래 단백질에 대한 체계적인 분석을 수행하여 열 안정성이 감소한 125개의 단백질을 식별했습니다. 이 중 102개는 이전에 알려진 금속 결합 단백질이었습니다. 또한, 사전 기능 주석이 없는 17개의 잠재적인 금속 결합 단백질이 발견되어 금속 결합 단백질의 역할에 대한 새로운 통찰력을 제공했습니다.
2. 잠재적인 금속 결합 단백질 GFPT2에 대한 아연 이온의 영향.
이들 17개의 잠재적인 금속 결합 단백질 중에서 연구자들은 GFPT2 단백질에 대한 심층적인 생화학적 검증을 수행하기로 결정했습니다. GFPT1/2는 육탄당 생합성 경로에서 첫 번째 속도 제한 효소 역할을 하며 UDP-GlcNAc라는 물질의 생성을 돕습니다. 연구자들은 아연 이온이 GFPT2와 상호 작용하여 그 활동을 억제한다는 것을 세포 수준에서 확인했습니다. 또한 그들은 아연 이온의 존재가 UDP-GlcNAc 수준의 상당한 감소로 이어진다는 것을 관찰했는데, 이는 아연 이온이 GFPT2의 활성을 억제함으로써 육탄당 생합성 경로를 조절한다는 것을 나타냅니다. 흥미롭게도 아연 이온은 GFPT2와 GFPT1의 활성을 억제하는 데 있어 서로 다른 선택성을 나타내며, 이는 새로운 조절 메커니즘이 있음을 시사합니다.
3. GFPT2 및 GLMS 효소의 활성에 대한 아연 이온의 분자 메커니즘을 해독합니다.
연구진은 대장균에서 GFPT2 단백질의 동족체를 분리해 일련의 생화학적 실험과 결정구조 분석을 진행했다. 연구 결과에 따르면 GLMS 단백질은 아연 이온과 결합하는 능력이 있으며, 특히 이러한 결합은 기질 결합 영역 근처에서 발생합니다. 이는 아연 이온이 GLMS 및 GFPT2의 활성 부위에서 결합을 위해 경쟁하거나 활성 부위와 배위 결합을 형성하여 두 효소의 활동을 방해할 수 있는 잠재적인 시나리오를 제시합니다.
4. 금속 킬레이터 TPEN은 아연 이온 결합 단백질을 특이적으로 인식할 수 있습니다.
마지막으로, 연구자들은 금속 킬레이터 TPEN을 사용하여 인간 단백질에서 금속 결합 단백질을 식별하기 위해 METAL-TPP의 능력을 확장했습니다. 실험 결과, 열 안정성이 감소된 150개의 단백질 중 110개(73%)가 알려진 금속 결합 단백질인 것으로 나타났으며, 이는 TPEN이 EDTA와 마찬가지로 금속 결합 단백질을 특이적으로 인식할 수 있음을 나타냅니다. 이 중 알려진 금속 결합 단백질 중 95개(86%)는 아연 이온 결합 단백질인 반면, EDTA로 인해 열 안정성이 감소된 단백질 중 41%만이 아연 이온 결합 단백질로 아연 이온 식별에 대한 TPEN의 선호도를 시사한다. - 결합 단백질.
확인된 40개의 잠재적인 금속 결합 단백질 중에서 저자는 예비 생화학적 검증을 위해 하나의 표적 단백질인 GPATCH11을 선택했고 이 단백질이 아연 이온 결합 단백질이라는 것을 발견했습니다.
5. METAL-TPP에서 두 가지 금속 킬레이트제의 인식 능력 비교.
연구진은 또한 METAL-TPP 단백질체학 데이터에서 열 안정성이 감소된 단백질을 식별하기 위해 두 가지 금속 킬레이터인 TPEN과 EDTA의 능력을 비교했습니다. 그들은 두 킬레이터에 의해 확인된 37개의 단백질 중 27개는 아연과 결합하는 것으로 알려졌고, 5개는 다른 금속과 결합하는 것으로 알려졌으며, 5개는 이전에 금속 결합 단백질로 주석이 달리지 않은 것으로 나타났습니다. 한 킬레이터에서는 열 안정성이 감소하고 다른 킬레이터에서는 열 안정성이 변하지 않거나 증가한 단백질의 경우, 연구자들은 METAL-TPP에 의한 식별 범위의 차이에 대한 두 가지 가능한 이유를 제시했습니다. 첫째, 각 킬레이터는 일부 단백질에서 결합 리간드로 작용하여 단백질을 더욱 안정하게 만들고 금속 결합으로 인한 불안정화 효과를 상쇄할 수 있습니다. 둘째, 분자 구조가 다르기 때문에 두 킬레이트제는 물에 대한 용해도도 크게 다릅니다. 따라서 향후 METAL-TPP 연구는 독특한 분자 구조를 가진 다른 킬레이터를 사용하여 수행되어 금속 단백질체의 범위를 보다 포괄적으로 탐색할 수 있습니다.
전반적으로, 이 연구는 금속 결합 단백질체학 조사를 수행하기 위한 강력한 도구 역할을 하는 새로운 방법인 METAL-TPP를 도입했습니다. 이러한 접근법을 통해 연구자들은 금속 결합 단백질을 체계적으로 식별하고 생물학적 기능 및 발병기전에서의 역할을 규명했습니다. 이러한 노력은 중요한 데이터베이스를 구축할 뿐만 아니라 금속 결합 단백질의 생화학적 기능과 약물 개발 잠재력을 이해하는 데 귀중한 통찰력을 제공하여 관련 분야의 추가 연구를 촉진합니다.