소분자 WA의 미스터리 공개: PHGDH 효소 조절에 대한 밝히고 새로운 항암 치료법의 길을 열다
필수 아미노산인 세린은 살아있는 유기체 내에서 다양한 중요한 생물학적 기능을 수행합니다. 이는 단백질 합성의 기본 구성요소일 뿐만 아니라 뉴클레오티드 합성, 메티오닌 대사 및 항산화 기능을 포함한 수많은 대사 경로의 조절에도 참여합니다. 이러한 경로 중에서 포스포피루베이트 탈수소효소(PHGDH)는 세린 합성 경로의 초기 단계를 촉매하여 3-포스포글리세레이트를 3-포스포하이드록시피루베이트로 전환하므로 중추적인 의미를 갖습니다. 세린 대사의 중심 역할을 고려할 때 PHGDH 기능의 모든 이상은 수많은 질병, 특히 암의 발병 및 진행과 복잡하게 연관되어 있습니다.
이 기사에서는 PHGDH를 공유적으로 억제할 수 있는 화합물을 식별하기 위해 화학적 단백질체학 및 표현형 분석 기술을 활용하는 혁신적인 접근 방식을 소개합니다. 대부분의 PHGDH 억제제는 일반적으로 본질적으로 경쟁적이지만, 저자는 천연 소분자인 Withangulatin A(WA)를 PHGDH의 새로운 공유 억제제로 제시합니다. WA는 PHGDH 억제제 개발을 위한 유망한 선도 화합물로 등장합니다. 더욱이 WA는 PHGDH와 세린 합성 경로(SSP)의 기능을 조사하기 위한 귀중한 프로브 역할을 합니다. 연구자들은 이 억제제를 활용하여 세린 대사를 관리하는 규제 메커니즘에 대한 더 깊은 통찰력을 얻음으로써 관련 질병, 특히 암에 대한 잠재적인 치료 방식을 탐색할 수 있는 길을 열었습니다.
이 발견은 새로운 약물 치료 전략 개발을 위한 유망한 방향을 제시할 뿐만 아니라 질병 진행에서 세린 대사의 역할에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다.
연구 경로
실험 과정
1. 세포 독성 실험에서 WP와 WA의 비교.
해당 연구에서 저자는 WP라는 복합 프로브를 고안하고 합성했습니다. 인간 결장암 세포(HCT-116)와 정상 결장 세포(NCM460)를 사용하여 저자는 WP가 WA와 비슷한 세포 독성을 나타냄을 관찰했습니다. 이는 알킨 마커의 포함이 세포독성 효과를 크게 변경하지 않았음을 시사합니다. 또한 저자는 WA가 정상 결장 세포에서는 낮은 세포 독성을 나타냈지만 결장암 세포에서는 더 높은 세포 독성을 나타내어 결장암 세포에 대한 선택성이 향상되었음을 강조했습니다.
그 후, 저자들은 HCT-116 세포에서 WP 프로브를 활용하는 ABPP(활동 기반 단백질 프로파일링) 전략을 사용했습니다. 이 접근법은 PHGDH를 WA의 직접적인 표적 단백질로 식별하게 했습니다. WB-풀다운 분석을 사용하여 실험적 검증을 수행하여 결과를 확인했습니다.
그림 1: Withangulatin A의 표적을 식별하기 위한 화학적 단백질체학 접근법.
2. WA와 PHGDH 간의 직접적인 상호 작용 확인.
활동 기반 단백질 프로파일링(ABPP) 기술을 활용하여 저자는 PHGDH가 HCT-116 세포에서 화합물 WA의 직접적인 표적으로 확인되었습니다. WA와 PHGDH 사이의 상호 작용을 검증하기 위해 저자는 DARTS(Drug Affinity Responsive Target Stability) 및 CETSA(Cellular Thermal Shift Assay) 실험을 수행했습니다. 결과는 WA가 PHGDH의 열 안정성을 향상시키고 그 활동을 크게 억제한다는 것을 보여주었습니다. 또한 BLI(Biolayer Interferometry) 실험은 WA와 PHGDH 사이의 직접적인 상호 작용에 대한 추가 확인을 제공했습니다.
저자는 또한 PHGDH에 결합하는 WA의 되돌릴 수 없는 특성을 조사했습니다. 그들의 실험에서는 PHGDH가 WP 결합을 방지한다는 사실이 밝혀졌습니다. 그러나 N-아세틸 시스테인(NAC) 또는 글루타티온(GSH)을 함유한 용액으로 사전 배양하면 WP와 PHGDH의 결합을 역전시킬 수 있습니다. 이러한 발견은 PHGDH 단백질의 WA와 시스테인 잔기 사이의 비가역적 공유 결합을 시사합니다.
그림 2: WA는 PHGDH에 직접 바인딩됩니다.
3. WA는 α-β-불포화 케톤 부분을 통해 PHGDH에 공유 결합합니다.
WA가 PHGDH와 상호작용하는 메커니즘을 더 자세히 밝히기 위해 연구자들은 α-β-불포화 케톤 구조를 통해 WA와 PHGDH의 공유 결합을 확인하는 실험을 수행했습니다. 처음에는 WA의 α,β-불포화 케톤 조각이 감소하여 WA-1을 생성했습니다(파트 그림 3A 참조). 세포 계수 키트-8(CCK-8) 분석 및 풀다운 단백질 상호 작용 분석(그림 3B 참조)을 사용한 후속 분석은 WA의 세포 독성 효과가 실제로 α 및 β-불포화 케톤 구조에 의존한다는 것을 보여주었습니다. 반대로, WA-1은 PHGDH가 WP에 결합하는 것을 효과적으로 방지하지 못하여(그림 3C 및 D 참조), 이에 따라 PHGDH에 대한 β-불포화 케톤의 공유 결합을 추가로 확인했습니다(그림 3E 참조).
종양 세포에서 세린 합성 경로(SSP) 과정을 차단하는 데 있어서 PHGDH 억제 또는 부재의 중요한 역할을 고려하여, 저자는 U-13C-포도당 안정 동위원소 표지를 사용하여 HCT-116 세포에서 SSP 활성에 대한 WA의 효과를 조사하기 시작했습니다(참조: 그림 3J). 실험 결과, WA는 HCT-116 세포에서 SSP 활성을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났습니다.
그림 3: WA는 PHGDH에 공유결합하여 PHGDH 활동을 억제합니다.
4. PHGDH의 Cys295 잔기는 WA에 공유 결합됩니다.
이론적으로 WA의 α 및 β-불포화 케톤 부분은 단백질의 시스테인 잔기와 공유 결합을 형성할 수 있습니다. 실제로 저자는 WA에 의한 PHGDH의 Cys295 잔기의 공유 결합 변형을 관찰했습니다. 이어서 그들은 PHGDH의 Cys295 잔기에 대한 WA의 공유 결합에 대한 추가 증거를 제공했으며 Cys295의 돌연변이가 PHGDH에 대한 WA의 억제 활성을 크게 감소시켰다는 것을 입증했습니다. 또한 BLI(Biolayer Interferometry) 실험에서는 WA와 재조합 Cys295A PHGDH 단백질 사이에 상호 작용이 없음이 밝혀져 WA와 PHGDH의 선택적 공유 결합이 확인되었습니다.
더욱이, 분자 역학 시뮬레이션은 WA가 PHGDH의 알로스테릭 조절자로서 기능하고 Cys295 잔기가 잠재적으로 PHGDH에 대한 새로운 알로스테릭 사이트 역할을 한다는 것을 나타냅니다.
그림 4. WA는 PHGDH의 Cys295 잔기에 선택적으로 공유 결합합니다.
그림 5: PHGDH의 알로스테릭 규제 부위인 Cys295 잔기
5. HCT-116 세포의 산화환원 균형에 대한 WA의 효과.
세린 합성 경로(SSP)는 산화환원 반응에 필수적인 글루타티온(GSH) 합성 및 NADPH 생산을 위한 전구체를 제공함으로써 세포 산화환원 균형을 유지하는 데 중추적인 역할을 합니다. 저자들은 HCT-116 세포의 산화환원 균형에 대한 WA의 영향을 조사한 결과 WA가 활성 산소종(ROS)의 수준을 증가시켜 결과적으로 GSH/GSSG 및 NADPH/NADP+ 비율을 감소시켜 산화 스트레스가 높아졌다는 것을 관찰했습니다.
웨스턴 블롯 분석에서는 CHK2 및 cyclin D1 발현 감소와 함께 γ H2AX, 절단된 카스파제3 및 절단된 PARP의 발현 증가가 나타났으며 이는 WA에 의한 세포사멸 유도를 암시합니다. 더욱이, PHGDH의 손실은 ROS 생성을 증가시키고, HCT-116 세포의 증식을 억제하며, PHGDH 발현이 낮은 세포에서 WA의 세포독성을 감소시키는 결과를 가져왔습니다. 이러한 발견은 HCT-116 세포에서 ROS 생산 및 WA 매개 세포 독성에서 PHGDH의 역할을 강조합니다.
그림 6: WA는 HCT-116 세포의 세포내 ROS 수준을 증가시킵니다.
6. 이종이식 모델의 세포 증식 효과.
생체 내에서 HCT-116 세포의 증식에 대한 WA의 영향을 평가하기 위해 저자는 HCT-116 세포를 사용하여 이종이식 모델을 확립했습니다. 결과에 따르면 WA는 체중이나 기관 형태에 큰 영향을 미치지 않아 독성이 낮음을 나타냅니다.
PHGDH 억제에 대한 WA의 선택성을 추가로 조사하기 위해 저자는 PHGDH 녹아웃(KO) HCT116 세포를 사용하여 이종이식 모델을 생성했습니다. 이 모델에서 PHGDH의 부재는 HCT-116 세포 증식을 현저하게 억제했습니다(그림 7, AC 참조). 또한, PHGDH KO HCT116 세포 이종이식 모델에서는 세포 증식 지표인 Ki67의 발현이 유의하게 감소하였다(도 7, D 참조).
특히, PHGDH KO HCT-116 세포를 사용한 이종이식 모델에서 WA는 세포 증식에 대한 유의한 억제 효과를 나타내지 않았으며(그림 7, EG 참조), HCT-116 세포에 대한 WA의 억제 효과가 PHGDH에 의존한다는 것을 추가로 확인했습니다.
그림 7: 생체 내 PHGDH KO HCT-116 세포의 증식에 대한 WA의 효과
이번 연구 결과는 PHGDH에 대한 향후 항암제 개발에 대한 핵심 단서를 제공할 뿐만 아니라 암치료 분야의 신약 개발에 대한 새로운 희망과 가능성을 제시한다.