Nieuwe therapeutische perspectieven voor traditionele geneeskunde: ABPP-technologie onthult Berberine's nieuwe ontstekingsremmende doelwit EIF2AK2
De traditionele geneeskunde wordt nieuw leven ingeblazen met nieuwe farmacologische toepassingen, omdat geavanceerde technieken zoals Activity-Based Protein Profiling (ABPP) licht werpen op voorheen onbekende therapeutische mechanismen. In deze context heeft de ABPP-technologie onlangs een nieuw ontstekingsremmend doelwit onthuld van berberine, een stof gewonnen uit traditionele Chinese geneeskrachtige planten en in China algemeen bekend als Coptisine of Huanglian. De ontdekking benadrukt dat EIF2AK2 een sleutelrol speelt in de ontstekingsremmende effecten van berberine, waardoor nieuwe wegen worden geopend voor het gebruik ervan bij de behandeling van ontstekingsgerelateerde ziekten. Deze doorbraak onderstreept het potentieel voor het herbestemmen en optimaliseren van traditionele medicijnen via moderne wetenschappelijke methoden.
Berberine, een traditionele alkaloïde met uitgebreide farmacologische effecten, waaronder ontstekingsremmende werking, hypoglykemie en cardiovasculaire bescherming, heeft veel aandacht getrokken. De precieze moleculaire mechanismen ervan, vooral bij het onderdrukken van ontstekingen, blijven echter onduidelijk.
Deze studie vult deze kenniskloof op met behulp van ABPP-technologie om EIF2AK2 te identificeren als een cruciaal doelwit van berberine vanwege zijn ontstekingsremmende werking. De bevindingen verdiepen ons begrip van het mechanisme van berberine en bieden een wetenschappelijke basis voor het herpositioneren van berberine en het ontwikkelen van nieuwe op EIF2AK2 gerichte ontstekingsremmende medicijnen.
Het team gebruikte geavanceerde chemoproteomische methoden om de interacties van berberine met intracellulaire eiwitten systematisch te onderzoeken, waarbij de specifieke binding aan EIF2AK2 en de modulatie van de enzymatische activiteit ervan werden bevestigd. Dit beïnvloedt de ontstekingsreactieroutes, waardoor de progressie van de ontsteking effectief wordt geremd. Deze belangrijke doorbraak biedt inzicht in het ontstekingsremmende mechanisme van berberine en ondersteunt de ontwikkeling van nieuwe therapieën gericht op EIF2AK2.
ChomiX biedt geavanceerde diensten zoals ABPP en CETSA om onderzoekers te helpen bij het onderzoeken van medicijnmechanismen en het versnellen van de ontwikkeling van nieuwe medicijnen.
Onderzoeksroute
Experimenteel proces
1. Probe 11b werd gebruikt als een functioneel hulpmiddel bij proteomics-onderzoek.
De auteurs synthetiseerden en screenden nieuwe BBR-fotoaffiniteitssondes die dibenzoylgroepen bevatten in door LPS + Nigericine geactiveerde THP-1-macrofagen. Hiervan vertoonden verbindingen 7a en 11b tijds- en dosisafhankelijke remmende effecten op de expressie van IL-1β, wat een verhoogde werkzaamheid aantoont vergeleken met de moederverbinding BBR. Door middel van Activity-Based Protein Profiling (ABPP)-analyse en fluorescentiescanning werd onderbouwd dat zowel 7a als 11b effectief binden aan hun doeleiwitten en competitieve remming vertonen, wat duidt op een werkingsmechanisme dat vergelijkbaar is met dat van BBR. Gebaseerd op de waarneming dat verbinding 11b duidelijke veranderingen in fluorescentie-intensiteit vertoonde binnen het concentratiebereik van 2,5% tot 25%, vooral bij een concentratie van 20 millimolair waar de fluorescentiesignaalvariatie het meest prominent was, werd deze gekozen als de functionele probe voor proteomics-studies. . Deze selectie was gebaseerd op zijn superieure reactievermogen, waardoor het geschikt is voor het ophelderen van eiwitinteracties in een proteomische setting.
Figuur 1: Screening en evaluatie van BBR-sondes.
2. De nieuwe probe 11b heeft 44 ontstekingsgerelateerde doeleiwitten van BBR in THP-1-cellen geïdentificeerd en heeft EIF2AK2, eEF1A1, PRDX3 en VPS4B onthuld als directe doelwitten met specifieke interacties met BBR.
De auteurs hebben via een reeks experimenten met succes de nieuwe probe 11b gebruikt om potentiële doeleiwitten in THP-1-cellen te labelen en te zuiveren. Hierna gebruikten ze LC-MS/MS-analyse om 44 ontstekingsgerelateerde eiwitten in het molecuulgewichtsbereik van 20 tot 80 kDa te identificeren, waarvan er zes potentieel een cruciale rol speelden in de ontstekingsremmende werking van BBR. In verder onderzoek werd bevestigd dat EIF2AK2, eEF1A1, PRDX3 en VPS4B directe doelwitten van BBR zijn, die competitieve remmende effecten vertonen onder hoge concentraties BBR-behandeling. Deze bevinding onthulde het waarschijnlijke bestaan van specifieke interacties tussen deze eiwitten en BBR, waardoor nieuwe inzichten werden verhelderd over hun betrokkenheid bij het medicijn tijdens de ontstekingsremmende processen.
Figuur 2: Vastlegging van doeleiwitten en functionele analyse.
3. Structureel biologisch onderzoek verduidelijkt hoe BBR de dimerisatie van EIF2AK2 moduleert om zijn ontstekingsremmende effecten uit te oefenen via kritische ioninteracties en kation-pi-binding.
De auteurs gebruikten CETSA-, SPR- en moleculaire dockingtechnieken om de interacties tussen BBR en vier eiwitten – EIF2AK2, eEF1A1, PRDX3 en VPS4B – in HEK-293-cellen te valideren. De resultaten toonden aan dat BBR de thermische stabiliteit van deze vier eiwitten verhoogde, waarbij de sterkste affiniteit werd waargenomen voor EIF2AK2. Uit verder onderzoek bleek dat de binding van BBR aan EIF2AK2 voornamelijk afhankelijk is van ionenparen waarbij D316 en E367 betrokken zijn in holte II, evenals kation-pi-interacties met K291. Deze bindingsplaats is betrokken bij de dimerisatie van EIF2AK2, wat suggereert dat BBR zijn ontstekingsremmende effecten zou kunnen uitoefenen door de dimerisatie van EIF2AK2 te moduleren.
Figuur 3: Affiniteitsstudies tussen BBR en zijn potentiële doelwitten.
4. De rol van BBR in ontstekings- en lipidenmetabolismeroutes wordt onthuld omdat het de dimerisatie en fosforylering van EIF2AK2 remt, waardoor een cruciale functie wordt aangetoond bij het reguleren van het NLRP3-inflammasoom, NF-kB p65/JNK/SIRT1-signalering.
Immunoprecipitatie-experimenten bevestigden dat BBR de dimerisatie van EIF2AK2 remt, waardoor zowel de autofosforylering van EIF2AK2 als de fosforylatie van zijn substraat eIF2a wordt beïnvloed, waardoor wordt onthuld dat BBR het NLRP3-inflammasoom, NF-kB p65, JNK-signaleringsroutes en SIRT1-expressie reguleert, en een cruciale rol speelt bij cellulaire ontstekingsreacties. ontstekingsremmende mechanismen in de hersenen (zoals bij de ziekte van Alzheimer) en door vetzuur geïnduceerde endoplasmatisch reticulumstress. Bovendien veranderde het tot zwijgen brengen of tot overexpressie brengen van EIF2AK2 de regulerende effecten van BBR op p-JNK en SIRT1 aanzienlijk, wat verder onderbouwt dat BBR werkt door binding aan EIF2AK2 om ontstekingsgerelateerde lipidenmetabolische stoornissen te reguleren.
Figuur 2 Vastlegging van doeleiwitten en functionele analyse.
5. Door zich te richten op EIF2AK2, eEF1A1, PRDX3 en VPS4B past BBR meerdere ontstekingsroutes aan, waarbij EIF2AK2 een dominante regulerende rol speelt onder deze doelen.
Om deze interactie verder te onderzoeken, hebben de auteurs overexpressie- en knockdown-modellen van de vier eiwitten opgesteld, wat aantoont dat BBR selectief JNK-, NF-kB-, MAPK- en AKT-inflammatoire routes moduleert, waarbij EIF2AK2 een dominante rol speelt, wat werd gevalideerd in in vivo experimenten. .
Figuur 5: Functionele studies van de BBR-doeleiwitten
6. Door specifieke targeting van EIF2AK2 reguleert BBR de in vivo secretie van IL-1β, IL-6, IL-18 en TNF-α; knockdown van het EIF2AK2-gen vermindert de ontstekingsremmende werkzaamheid en leverbeschermende werking.
Vervolgens onderzochten ze of BBR de afgifte van IL-1β, IL-6, IL-18 en TNF-α beïnvloedt door zich in vivo op EIF2AK2 te richten. Om dit te doen, creëerden ze een EIF2AK2-gen knock-out muismodel met behulp van intraveneuze injectie van adeno-geassocieerd virus (AAV) dat shEIF2AK2 draagt. Wildtype en EIF2AK2 knock-out muizen kregen intraperitoneaal BBR (3 mg/kg) toegediend, gevolgd door LPS-injectie. Terwijl BBR de niveaus van IL-1β, IL-6, IL-18 en TNF-α in de controlegroep aanzienlijk verlaagde, werd dit effect verzwakt in de EIF2AK2 knock-outgroep. Histologisch onderzoek via H&E-kleuring van leverweefsel gaf aan dat het verbeterende effect van BBR op de infiltratie van leverontsteking verzwakt was bij EIF2AK2 knock-out muizen. Deze bevindingen suggereren dat BBR mogelijk de secretie van IL-1β, IL-6, IL-18 en TNF-α downreguleert door zich te richten op EIF2AK2 en een goede veiligheid vertoont.
Figuur 6: functionele verificaties van EIF2AK2 in vivo.
Deze studie demonstreert volledig de krachtige voordelen van ABPP-technologie bij het ophelderen van de complexe mechanismen van bioactieve moleculen zoals berberine, waardoor de vooruitgang van modern onderzoek naar traditionele medicijnen wordt gestimuleerd. Door nieuwe doelwitten en werkingsmechanismen voor het oude medicijn berberine bloot te leggen, verrijkt het niet alleen ons begrip van de biologische functies van traditionele medicijnen, maar opent het ook nieuwe perspectieven en mogelijkheden voor de behandeling van ontstekingsgerelateerde ziekten. Deze uitkomst voorspelt dat, met de steun van moderne wetenschappelijke technieken zoals ABPP, meer traditionele medicijnen een nieuwe bestemming zullen krijgen door de identificatie van hun specifieke doelwitten en mechanismen, waardoor ze een belangrijke bijdrage zullen leveren aan de inspanningen op het gebied van de menselijke gezondheid.
Referentie:https://doi.org/10.1016/j.apsb.2022.12.009.