Producten
Competitieve chemoproteomische profilering van eiwitdoelen voor covalente geneesmiddelen met kleine moleculen
Technische kenmerken van het platform
Net als bij niet-covalente geneesmiddelen is de directe pulldown-strategie door gebruik te maken van chemische probes gefunctionaliseerd met reportergroepen ook met succes aangetoond voor covalente geneesmiddelen met kleine moleculen. Het is echter vermeldenswaard dat sommige covalente geneesmiddelen intolerant zijn voor chemische modificaties als gevolg van verlies aan bioactiviteit of synthetische ontoegankelijkheid. Bovendien is de gevormde covalente binding gewoonlijk onstabiel tijdens MS-detectie.
Competitieve chemoproteomische strategie is een ideaal alternatief, dat gebruik maakt van een universele, op activiteit gebaseerde probe voor eiwitlabeling. Er zijn specifieke chemische probes ontwikkeld om te reageren met cysteïne-, lysine-, serine- en histidineresiduen. In principe kan het aminozuurresidu, als het eenmaal is ingenomen door een covalent klein molecuul, niet door de probe worden gemerkt. Als gevolg hiervan konden de ON- en OFF-doelen uitgebreid worden geïdentificeerd door deze competitieve strategie met de resolutie van aminozuren.
Werkstroom
Het platform volgt een gestructureerde workflow, beginnend met het labelen van levende cellen met covalente moleculen, gevolgd door stappen zoals gelabelde proteoomextractie, chemische probe-labeling, bioorthogonale ligatie, op streptavidine gebaseerde verrijking, proteasevertering, isotopische labeling en uiteindelijke massaspectrometriedetectie.
Casestudy
Projectdoel
AMG510, ontwikkeld door Amgen, is het eerste goedgekeurde medicijn dat zich richt op de KRAS-G12C-mutatie in tumoren. Het doel van het project was om de aan- en uitdoelen van AMG510 in NCI-H358-cellen met de KRAS-G12C-mutatie te profileren.
Experimentele methode
DIA-ABPP, een van de kerntechnologieplatforms in ChomiX, werd gebruikt om de beoogde bezetting op proteoomniveau te analyseren.
Datavisualisatie
Een totaal van 16992 Cys-plaatsen van 5768 eiwitten werden gekwantificeerd in NCI-H358-cellen. De beoogde bezetting van de KRAS_C12-locatie was bijna 100% onder de behandeling van 1 μM AMG510ter plaatse, terwijl de andere site, KRAS_C80, niet werd beïnvloed. Deze gegevens toonden de hoge doelspecificiteit van AMG510 aan. (De gelabelde Cys-residuen zijn aangegeven met *)
