Nowe perspektywy terapeutyczne dla medycyny tradycyjnej: Technologia ABPP odkrywa nowatorski cel przeciwzapalny berberyny EIF2AK2
Tradycyjna medycyna jest ożywiana dzięki nowym zastosowaniom farmakologicznym, ponieważ zaawansowane techniki, takie jak profilowanie białek w oparciu o aktywność (ABPP), rzucają światło na nieznane wcześniej mechanizmy terapeutyczne.W tym kontekście technologia ABPP ujawniła niedawno nowy cel przeciwzapalny, jakim jest berberyna, związek ekstrahowany z tradycyjnych chińskich roślin leczniczych, powszechnie znany w Chinach jako koptyzyna lub huanglian.Odkrycie podkreśla, że EIF2AK2 odgrywa kluczową rolę w działaniu przeciwzapalnym berberyny, otwierając nowe możliwości jej zastosowania w leczeniu chorób związanych ze stanem zapalnym.To przełomowe odkrycie podkreśla potencjał zmiany przeznaczenia i optymalizacji tradycyjnych leków za pomocą nowoczesnych metod naukowych.
Dużą uwagę przykuwa berberyna, tradycyjny alkaloid o szerokim działaniu farmakologicznym, w tym przeciwzapalnym, hipoglikemicznym i chroniącym układ sercowo-naczyniowy.Jednak jego dokładne mechanizmy molekularne, szczególnie w tłumieniu stanu zapalnego, pozostają niejasne.
Niniejsze badanie wypełnia tę lukę w wiedzy, wykorzystując technologię ABPP do zidentyfikowania EIF2AK2 jako krytycznego celu zaangażowanego przez berberynę w jej działaniu przeciwzapalnym.Odkrycia pogłębiają naszą wiedzę na temat mechanizmu działania berberyny i dostarczają naukowych podstaw do zmiany położenia berberyny i opracowania nowych leków przeciwzapalnych ukierunkowanych na EIF2AK2.
Zespół zastosował zaawansowane metody chemoproteomiczne do systematycznego badania interakcji berberyny z białkami wewnątrzkomórkowymi, potwierdzając jej specyficzne wiązanie z EIF2AK2 i modulację jej aktywności enzymatycznej.Wpływa to na szlaki odpowiedzi zapalnej, skutecznie hamując postęp stanu zapalnego.Ten znaczący przełom zapewnia wgląd w mechanizm przeciwzapalny berberyny i wspiera rozwój nowych terapii ukierunkowanych na EIF2AK2.
ChomiX świadczy najnowocześniejsze usługi, takie jak ABPP i CETSA, aby pomóc badaczom w badaniu mechanizmów działania leków i przyspieszaniu prac nad nowymi lekami.
Trasa Badawcza
Proces eksperymentalny
1. Sonda 11b została wykorzystana jako narzędzie funkcjonalne w badaniach proteomicznych.
Autorzy zsyntetyzowali i przebadali nowe sondy fotopowinowactwa BBR zawierające grupy dibenzoilowe w makrofagach THP-1 aktywowanych LPS + nigerycyną.Wśród nich związki 7a i 11b wykazywały zależne od czasu i dawki działanie hamujące na ekspresję IL-1β, wykazując zwiększoną skuteczność w porównaniu ze związkiem macierzystym BBR.Dzięki analizie profilowania białek opartego na aktywności (ABPP) i skanowaniu fluorescencyjnemu udowodniono, że zarówno 7a, jak i 11b skutecznie wiążą się z białkami docelowymi i wykazują hamowanie konkurencyjne, wskazując w ten sposób mechanizm działania podobny do BBR.Na podstawie obserwacji, że związek 11b wykazywał wyraźne zmiany w intensywności fluorescencji w zakresie stężeń od 2,5% do 25%, szczególnie w stężeniu 20 milimoli, gdzie zmienność sygnału fluorescencji była najbardziej widoczna, wybrano go jako funkcjonalną sondę do badań proteomicznych .Wybór ten opierał się na jego doskonałej responsywności, co czyni go odpowiednim do wyjaśniania interakcji białek w warunkach proteomicznych.
Rysunek 1: Przegląd i ocena sond BBR.
2. Nowatorska sonda 11b zidentyfikowała 44 białka docelowe BBR związane ze stanem zapalnym w komórkach THP-1 i ujawniła, że EIF2AK2, eEF1A1, PRDX3 i VPS4B są bezpośrednimi celami ze specyficznymi interakcjami z BBR.
Autorzy, w drodze serii eksperymentów, z powodzeniem zastosowali nową sondę 11b do znakowania i oczyszczania potencjalnych białek docelowych w komórkach THP-1.Następnie wykorzystali analizę LC-MS/MS do zidentyfikowania 44 białek związanych ze stanem zapalnym w zakresie masy cząsteczkowej od 20 do 80 kDa, spośród których sześć uznano za potencjalnie odgrywające kluczową rolę w działaniu przeciwzapalnym BBR.W dalszych badaniach potwierdzono, że EIF2AK2, eEF1A1, PRDX3 i VPS4B są bezpośrednimi celami BBR, wykazując konkurencyjne działanie hamujące przy wysokich stężeniach leczenia BBR.Odkrycie to ujawniło prawdopodobne istnienie specyficznych interakcji pomiędzy tymi białkami i BBR, wyjaśniając w ten sposób nowe spostrzeżenia na temat ich zaangażowania w lek podczas jego procesów przeciwzapalnych.
Rysunek 2: Wychwytywanie białek docelowych i analiza funkcjonalna.
3. Badania z zakresu biologii strukturalnej wyjaśniają, w jaki sposób BBR moduluje dimeryzację EIF2AK2, aby wywierać działanie przeciwzapalne poprzez krytyczne interakcje jonowe i wiązanie kation-pi.
Autorzy zastosowali techniki CETSA, SPR i dokowanie molekularne, aby zweryfikować interakcje między BBR i czterema białkami – EIF2AK2, eEF1A1, PRDX3 i VPS4B – w komórkach HEK-293.Wyniki pokazały, że BBR zwiększył stabilność termiczną tych czterech białek, przy czym największe powinowactwo zaobserwowano w przypadku EIF2AK2.Dalsze badania wykazały, że wiązanie BBR z EIF2AK2 opiera się głównie na parach jonowych obejmujących D316 i E367 we wnęce II, a także na interakcjach kation-pi z K291.To miejsce wiązania bierze udział w dimeryzacji EIF2AK2, co sugeruje, że BBR może wywierać działanie przeciwzapalne poprzez modulowanie dimeryzacji EIF2AK2.
Rysunek 3: Badania powinowactwa pomiędzy BBR i jego potencjalnymi celami.
4. Ujawniono rolę BBR w szlakach zapalnych i metabolizmu lipidów, ponieważ hamuje on dimeryzację i fosforylację EIF2AK2, wykazując w ten sposób kluczową funkcję w regulacji sygnalizacji inflamasomu NLRP3, NF-kB p65/JNK/SIRT1.
Eksperymenty z immunoprecypitacją potwierdziły, że BBR hamuje dimeryzację EIF2AK2, wpływając zarówno na autofosforylację EIF2AK2, jak i fosforylację jego substratu eIF2a, ujawniając w ten sposób, że BBR reguluje inflamasom NLRP3, NF-kB p65, szlaki sygnałowe JNK i ekspresję SIRT1, odgrywając kluczową rolę w komórkowych odpowiedziach zapalnych, mechanizmy przeciwzapalne mózgu (takie jak w chorobie Alzheimera) i stres siateczki śródplazmatycznej wywołany kwasami tłuszczowymi.Dodatkowo wyciszenie lub nadekspresja EIF2AK2 znacząco zmieniło wpływ regulacyjny BBR na p-JNK i SIRT1, co dodatkowo potwierdza, że BBR działa poprzez wiązanie z EIF2AK2 w celu regulacji zaburzeń metabolizmu lipidów związanych ze stanem zapalnym.
Rycina 2 Wychwytywanie białek docelowych i analiza funkcjonalna.
5. Celując w EIF2AK2, eEF1A1, PRDX3 i VPS4B, BBR reguluje wiele szlaków zapalnych, przy czym EIF2AK2 odgrywa dominującą rolę regulacyjną wśród tych celów.
Aby dokładniej zbadać tę interakcję, autorzy stworzyli modele nadekspresji i knockdown czterech białek, wykazując, że BBR selektywnie moduluje szlaki zapalne JNK, NF-kB, MAPK i AKT, przy czym EIF2AK2 odgrywa dominującą rolę, co potwierdzono w eksperymentach in vivo .
Rycina 5: Badania funkcjonalne białek docelowych BBR
6. Poprzez specyficzne ukierunkowanie na EIF2AK2, BBR reguluje w dół wydzielanie in vivo IL-1β, IL-6, IL-18 i TNF-α;wyłączenie genu EIF2AK2 zmniejsza jego skuteczność przeciwzapalną i działanie ochronne na wątrobę.
Następnie zbadali, czy BBR wpływa na uwalnianie IL-1β, IL-6, IL-18 i TNF-α, celując w EIF2AK2 in vivo.W tym celu stworzyli mysi model z nokautem genu EIF2AK2, stosując dożylne wstrzyknięcie wirusa związanego z adenowirusem (AAV) przenoszącego shEIF2AK2.Myszom typu dzikiego i z nokautem EIF2AK2 podano dootrzewnowo BBR (3 mg/kg), a następnie wstrzyknięto LPS.Podczas gdy BBR znacząco obniżył poziomy IL-1β, IL-6, IL-18 i TNF-α w grupie kontrolnej, efekt ten został osłabiony w grupie z nokautem EIF2AK2.Badanie histologiczne poprzez barwienie tkanki wątroby H&E wykazało, że łagodzący wpływ BBR na nacieki zapalenia wątroby był osłabiony u myszy z nokautem EIF2AK2.Odkrycia te sugerują, że BBR potencjalnie zmniejsza wydzielanie IL-1β, IL-6, IL-18 i TNF-α poprzez celowanie w EIF2AK2 i wykazuje dobre bezpieczeństwo.
Rysunek 6: Weryfikacje funkcjonalne EIF2AK2 in vivo.
Badanie to w pełni demonstruje potężne zalety technologii ABPP w wyjaśnianiu złożonych mechanizmów cząsteczek bioaktywnych, takich jak berberyna, napędzając postęp nowoczesnych badań nad tradycyjnymi lekami.Odkrywając nowe cele i mechanizmy działania starej berberyny, leku, nie tylko wzbogaca naszą wiedzę na temat biologicznych funkcji tradycyjnych leków, ale także otwiera nowe perspektywy i możliwości leczenia chorób związanych ze stanami zapalnymi.Wynik ten zapowiada, że przy wsparciu nowoczesnych technik naukowych, takich jak ABPP, bardziej tradycyjne leki zostaną ponownie wykorzystane poprzez identyfikację ich konkretnych celów i mechanizmów, wnosząc znaczący wkład w wysiłki na rzecz zdrowia ludzkiego.
Odniesienie:https://doi.org/10.1016/j.apsb.2022.12.009.