[Krajowe finansowanie kluczowych projektów] Odkrywanie białek wiążących metale: przełomy w METAL-TPP i innowacje w zakresie odkrywania leków
Białka wiążące metale to kluczowe składniki tworzące stabilne kompleksy z jonami metali, pełniące różne funkcje życiowe w organizmach żywych, w tym sygnalizację komórkową, katalizowanie reakcji biochemicznych i utrzymywanie homeostazy jonów metali. Ich rozregulowanie wiąże się z chorobami takimi jak rak, zaburzenia neurologiczne i choroby metaboliczne. Zrozumienie ich roli w patogenezie chorób ma kluczowe znaczenie dla diagnozy i leczenia. Co więcej, białka wiążące metale są ważnymi celami w opracowywaniu leków, ponieważ wiele leków wchodzi z nimi w interakcje, wywierając działanie terapeutyczne. W tym badaniu naukowcy wprowadzili METAL-TPP, najnowocześniejszą metodę proteomiki chemicznej. Łącząc ilościową analizę proteomiczną termostabilności (TPP) z identyfikacją białek wiążących metale, METAL-TPP umożliwia skuteczne i dokładne wykrywanie białek wiążących metale. W szczególności reguluje termostabilność białek za pomocą szeregu chelatorów metali, ułatwiając precyzyjną identyfikację czystych białek i lizatów komórkowych. To innowacyjne podejście oferuje nowy wgląd w funkcję i mechanizmy białek wiążących metale, wspomagając badania biologiczne, zrozumienie chorób i opracowywanie leków. Keloxi Biology świadczy zaawansowane ABPP, TPP i inne usługi techniczne w zakresie badań i rozwoju farmaceutycznego, wspierając badaczy w badaniu mechanizmów działania leków i usprawnianiu procesów opracowywania nowych leków.
Proces eksperymentalny
1. Przy użyciu METAL-TPP zidentyfikowano siedemnaście potencjalnych białek wiążących metale.
Początkowo badacze oceniali skuteczność chelatacji metali o szerokim spektrum działania przy użyciu EDTA w przypadku czystych białek i lizatów komórkowych. Zaobserwowali, że METAL-TPP skutecznie wykrywał zmniejszenie stabilności termicznej białek wiążących metale. Następnie przeprowadzono systematyczną analizę białek pochodzenia ludzkiego przy użyciu METAL-TPP, identyfikując 125 białek wykazujących obniżoną termostabilność. Spośród nich 102 to znane wcześniej białka wiążące metale. Ponadto odkryto 17 potencjalnych białek wiążących metale bez wcześniejszych adnotacji funkcjonalnych, co dało nowy wgląd w rolę białek wiążących metale.
2. Wpływ jonów cynku na potencjalne białko wiążące metale GFPT2.
Spośród tych 17 potencjalnych białek wiążących metale naukowcy zdecydowali się przeprowadzić dogłębną walidację biochemiczną białka GFPT2. GFPT1/2 służy jako pierwszy enzym ograniczający szybkość w szlaku biosyntezy heksozy, pomagając w wytwarzaniu substancji zwanej UDP-GlcNAc. Naukowcy potwierdzili na poziomie komórkowym, że jony cynku oddziałują z GFPT2, hamując jego aktywność. Dodatkowo zaobserwowali, że obecność jonów cynku prowadzi do znacznego obniżenia poziomu UDP-GlcNAc, co wskazuje, że jony cynku regulują szlak biosyntezy heksozy poprzez hamowanie aktywności GFPT2. Co ciekawe, jony cynku wykazują różną selektywność w hamowaniu aktywności GFPT2 i GFPT1, co sugeruje obecność nowego mechanizmu regulacyjnego.
3. Rozszyfrowanie mechanizmu molekularnego jonów cynku na aktywność enzymu GFPT2 i GLMS.
Naukowcy wyizolowali homolog białka GFPT2 z E. coli i przeprowadzili serię eksperymentów biochemicznych oraz analiz struktury krystalicznej. Odkrycia ujawniły, że białko GLMS ma zdolność wiązania jonów cynku, a wiązanie to ma miejsce w pobliżu regionu wiązania substratu. Sugeruje to potencjalny scenariusz, w którym jony cynku mogłyby konkurować o wiązanie w miejscu aktywnym GLMS i GFPT2 lub utrudniać aktywność obu enzymów poprzez tworzenie wiązań koordynacyjnych z ich miejscami aktywnymi.
4.Chelator metali TPEN może specyficznie rozpoznawać białka wiążące jony cynku.
Wreszcie badacze rozszerzyli możliwości METAL-TPP w zakresie identyfikacji białek wiążących metale w białkach ludzkich przy użyciu chelatora metali TPEN. Wyniki eksperymentów wykazały, że spośród 150 białek o obniżonej stabilności termicznej 110 (73%) to białka wiążące metale, co wskazuje, że TPEN, podobnie jak EDTA, może specyficznie rozpoznawać białka wiążące metale. Wśród nich 95 (86%) znanych białek wiążących metale to białka wiążące jony cynku, podczas gdy tylko 41% białek o obniżonej stabilności termicznej spowodowanej przez EDTA to białka wiążące jony cynku, co sugeruje, że TPEN preferuje identyfikację jonów cynku -białka wiążące.
Spośród 40 zidentyfikowanych potencjalnych białek wiążących metal autorzy wybrali jedno białko docelowe, GPATCH11, do wstępnej walidacji biochemicznej i odkryli, że białko to jest białkiem wiążącym jony cynku.
5. Porównanie zdolności rozpoznawania dwóch chelatorów metali w METAL-TPP.
Naukowcy porównali także zdolność dwóch chelatorów metali, TPEN i EDTA, do identyfikacji białek o obniżonej stabilności termicznej w danych proteomicznych METAL-TPP. Odkryli, że spośród 37 białek zidentyfikowanych przez oba chelatory, 27 wiązało cynk, 5 wiązało inne metale, a 5 wcześniej nie było opisywanych jako białka wiążące metale. W przypadku białek, których stabilność termiczna spadła w przypadku jednego chelatora, a pozostała niezmieniona lub zwiększona w drugim, badacze zasugerowali dwie możliwe przyczyny różnicy w zakresie identyfikacji przez METAL-TPP. Po pierwsze, każdy chelator może działać jako ligand wiążący w niektórych białkach, czyniąc je bardziej stabilnymi i przeciwdziałając destabilizującemu efektowi spowodowanemu wiązaniem metali. Po drugie, ze względu na różne struktury molekularne, oba chelatory mają również znacznie różną rozpuszczalność w wodzie. Zatem przyszłe badania METAL-TPP można przeprowadzić przy użyciu innych chelatorów o unikalnych strukturach molekularnych, aby w sposób bardziej kompleksowy zbadać zakres metaloproteomu.
Ogólnie rzecz biorąc, w ramach tego badania wprowadzono nowatorską metodę METAL-TPP, która stanowi potężne narzędzie do prowadzenia badań proteomicznych związanych z wiązaniem metali. Dzięki takiemu podejściu badacze systematycznie identyfikowali białka wiążące metale i wyjaśniali ich rolę w funkcjach biologicznych i patogenezie. W ramach tego przedsięwzięcia nie tylko utworzono ważne bazy danych, ale także dostarczono cennych informacji pozwalających zrozumieć funkcje biochemiczne i potencjał opracowywania leków białek wiążących metale, wspierając w ten sposób dalsze badania w pokrewnych dziedzinach.
Odniesienie:,https://www.nature.com/articles/s41589-024-01563-y.