ABPP tahlili oqsil-metabolit o'zaro ta'siri orqali itakon kislotasining yangi yallig'lanishga qarshi mexanizmini ochib beradi.
Yallig'lanish va immunitetni tartibga solish uchun muhim bo'lgan endogen metabolit bo'lgan Itaconate uning roli ChomiX Biotech jamoasining qo'shma maqolasida yoritilgan. Tadqiqot innovatsion ravishda ABPP texnologiyasidan foydalangan holda, itakonat asosiy glikolitik fermentlarda sistein qoldiqlarining S-glikozillanishini o'zgartiradi va shu bilan hujayra metabolizmiga ta'sir qiladi. Tadqiqotchilar oqsil-itakonat o'zaro ta'sirini xaritalashdi, itakonat glikoliz yo'lidagi bir nechta fermentlarni to'g'ridan-to'g'ri bog'laydi va boshqaradi, bu uning tezligi va yo'nalishiga ta'sir qiladi. Ushbu tadqiqot kasallik bilan bog'liq yallig'lanish paytida metabolik nazorat mexanizmlari haqidagi bilimimizni oshiradi va kichik molekulalar oqsil funktsiyalarini qanday o'zgartirishini o'rganishda ABPP kuchini namoyish etadi. Kimyoviy proteomikaning etakchisi sifatida Corolus BioScience mijozlarga o'xshash metabolik tartibga solish mexanizmlarini ochishda yordam berish uchun prob dizayni, namunalarni qayta ishlash, yuqori o'tkazuvchanlik skriningi va ma'lumotlarni tahlil qilish kabi keng qamrovli echimlarni taklif etadi.
1. 1-OH-Az prob bilan Itaconate modifikatsiyalarini aniqlash
Ushbu tadqiqotda mualliflar itakonatga mo'ljallangan sistein qoldiqlarini tekshirish uchun ilg'or profillash usullaridan foydalanganlar. Dastlab ular gel elektroforez orqali 1-OH-Az probini baholadilar va IA-alkin yordamida raqobatbardosh tajribalar o'tkazdilar. Mass-spektrometriya tekshiruvi 1-OH-Az sistein joylarini tanlab belgilashini tasdiqladi, yangi aniqlangan oqsillarning 87 foizi ilgari DrugBank-da ligand bog'lovchi oqsillar sifatida hujjatlashtirilmagan. Ushbu oqsillarning turli funktsiyalari va kasalliklarga tegishliligini hisobga olgan holda, 1-OH-Az probi faol sisteinlarni yangi terapevtiklar uchun potentsial dori maqsadlari sifatida aniqlash uchun ishlatilishi mumkin.
1-rasm: 1-OH-Az Itaconate modifikatsiyalarini aniqlash uchun samarali va o'ziga xos sistein tahlili probi sifatida
2. Miqdoriy proteomika usullaridan foydalangan holda Itaconate modifikatsiyalash joylarini aniqlash
Tadqiqotchilar 1-OH-Az zond yordamida itakonat tomonidan o'zgartirilgan sistein qoldiqlarini aniqlash uchun izoTOP-ABPP tajribalarini o'tkazdilar. Lizat bilan oldindan ishlov berishdan so'ng, itakonatning turli konsentratsiyalari ta'sirini tahlil qilish, uning o'ziga xos maqsadlarini aniqlash uchun izotopik etiketli bog'lovchi yordamida miqdoriy proteomikadan foydalanildi. Qiyosiy tajribalar, shuningdek, IA-alkinning ikkita konsentratsiyasi yordamida amalga oshirildi, ular kengroq faollik va qamrovni ko'rsatgan holda, faqat 65 va 50 ta samarali raqobatdosh saytlarni tan oldi. Shunisi e'tiborga loyiqki, 1-OH-Az birgalikdagi sisteinlar orasida sezilarli darajada yuqori raqobatdosh ustunlikni namoyish etdi.
2-rasm: 1-OH-Az bilan raqobatbardosh izoTOP-ABPPdan foydalangan holda Itaconate-modified sisteinlarning kimyoviy proteomik tahlili
3. Itaconate asosiy glikolitik fermentni o'zgartiradi va inhibe qiladi
Mass-spektrometrik tahlil shuni ko'rsatdiki, itakonat uchta asosiy glikolitik fermentni o'zgartiradi: ALDOA, GAPDH va LDHA. ALDOA ning Cys73 va Cys339 da endogen itakonat modifikatsiyasi LPS-stimulyatsiya qilingan Raw264.7 hujayralarida tasdiqlangan. Ularning yaqinligi tufayli mualliflar bunday o'zgarishlar aldolaz faolligiga ta'sir qilishi mumkinligini taxmin qilishdi. Haqiqatan ham, 1 mM itakonat bilan davolash ALDOA fermenti faolligini protein ifodasiga ta'sir qilmasdan pasayishiga olib keldi. Bundan tashqari, isoTOP-ABPP tahlillari shuni ko'rsatdiki, LDHAdagi Cys84 va GAPDHdagi Cys245 ham itakonat modifikatsiyasi uchun maqsaddir.
3-rasm: Itaconate ALDOA funktsiyasini o'zgartirishi va buzishi mumkin
4. Itaconate asosan ALDOA ni maqsad qilib olgan holda glikolizni bostiradi
ITACning yallig'lanishli makrofag glikolizidagi tartibga soluvchi rolini baholash uchun mualliflar LPS stimulyatsiyasidan oldin va keyin Raw264.7 hujayralarida glyukoza iste'moli va laktat ishlab chiqarishni kuzatdilar, bu ITAC ikkalasini ham sezilarli darajada kamaytirganini ko'rsatdi, bu glikolitik funktsiyani bostirishni ko'rsatadi. ITAC ning ALDOA ga ta'sirini va keyinchalik glikolizni inhibe qilishini tasdiqlash uchun ular RNK yordamida endogen ALDOA ni yo'q qilishdi va Raw264.7 hujayralarida WT yoki ikki mutant (C73S/C339S) ALDOA ni haddan tashqari ifodalashdi. Kutilganidek, ALDOA ning ishdan chiqishi glyukoza iste'moli va laktat ishlab chiqarishning kamayishiga olib keldi va hujayralarni ITAC bilan davolashga befarq qoldirdi. WT yoki mutant ALDOA ning qayta kiritilishi davolanmagan hujayralardagi metabolik darajalarni tikladi; ammo mutant ALDOA ni haddan tashqari ifodalovchi hujayralar WT bilan solishtirganda glikolitik inhibisyonga nisbatan sezgirlikni kamaytirdi. Glikolitik holatlarga mos keladigan aldolaz faolligi uchun fermentativ tahlillar.
4-rasm: Itaconate ALDOA ni o'zgartirish orqali glikolitik yo'lni o'zgartiradi
5. ALDOA ni inhibe qilish yallig'lanishga qarshi ta'sirga hissa qo'shadi
Ushbu topilmalar ITAC ALDOA da Cys73 va Cys339 sistein qoldiqlarini o'zgartirish orqali glikolitik yo'l faolligini bostirishini ochib berdi. Mualliflar dimetil fumaratning GAPDH ga sistein modifikatsiyasi va glikolitik inhibisyon orqali ma'lum bo'lgan yallig'lanishga qarshi ta'siridan ITAC ham xuddi shunday tarzda yallig'lanishga qarshi ta'sir ko'rsatish uchun glikolizga xalaqit berishi mumkinligi haqida xulosa qilishdi. ALDOA ning ishdan chiqishi LPS stimulyatsiyasida IL-1b sekretsiyasini sezilarli darajada kamaytirdi, bu uning glikoliz orqali yallig'lanishni tartibga solishda ishtirok etishini ko'rsatadi. ALDOA ning yallig'lanishga qarshi ta'sirini qo'shimcha piruvat bilan qisman bekor qilish LDHA ning yallig'lanish reaktsiyalarida cheklangan rolini ko'rsatdi.
5-rasm: Itakonatning yallig'lanishga qarshi ta'siri ALDOA ni inhibe qilish orqali amalga oshiriladi, bu esa glikolizning buzilishiga olib keladi.
Xulosa qilib aytganda, ushbu maqola itakonat va tegishli oqsillar o'rtasidagi o'zaro ta'sirlar tarmog'ini yaratish uchun S-glikozilatsiyaga asoslangan sistein profilini yaratish texnologiyalari va ABPP metodologiyalaridan samarali foydalandi. Bu itakonat glikolitik yo'lni nazorat qilish uchun oqsillardagi sistein qoldiqlarini maxsus modifikatsiyalash orqali muhim metabolik regulyator bo'lib xizmat qilishini ishonchli tarzda ko'rsatadi. Ushbu tadqiqot nafaqat itakonatning yangi metabolik regulyator sifatida ta'sir qilish mexanizmini yoritibgina qolmay, balki asosiy metabolik yo'llarni modulyatsiya qilish uchun kichik metabolitlarning oqsillar bilan qanday o'zaro ta'siri haqida ishonchli dalillarni taqdim etadi.
ABPPga qo'shimcha ravishda, kichik molekula metabolitlari va oqsillar o'rtasidagi o'zaro ta'sirni o'rganishning boshqa usullari quyidagilarni o'z ichiga oladi, lekin ular bilan cheklanmaydi:
1. Yaqinlikni boyitish (pastga tortiladigan)usullar, bunda mahalliy birikma hujayra lizatlari bilan inkubatsiya qilinadigan biotinillangan zondga aylantiriladi, so'ngra streptavidin vositachiligida boyitiladi va biotin probiga bog'langan oqsil maqsadlari ajratiladi.
2.Cheklangan proteoliz massa spektrometriyasi (LiP-MS)oqsil yaqinligiga asoslangan maqsadli kashfiyot texnologiyasidir. Dori vositalari yoki kichik molekulalar kabi o'ziga xos ligandlar ma'lum oqsillarga bog'langanda, ular bog'lanmagan oqsilga nisbatan differensial parchalanish joylariga olib keladigan konformatsion o'zgarishlar yoki sterik to'siqlarni keltirib chiqaradi. Mass-spektrometriya yordamida bu farqlarni aniqlash orqali ushbu usul hujayra ichidagi dori-oqsil o'zaro ta'sirini aniqlashi va preparatning molekulyar maqsadlarini aniqlashi mumkin.
3.Uyali termal siljish tahlili (CETSA)dastlab saratonga qarshi dori maqsadini tadqiq qilishda yordam berish uchun ishlab chiqilgan va buzilmagan hujayralardagi dori maqsadli ishtirokini o'rganish uchun birinchi keng qo'llaniladigan yorliqsiz usullardan biridir. CETSA, birinchi navbatda, maqsadli oqsil bilan bog'langanda, birikma uning termal barqarorligini oshiradi degan tamoyilga tayanadi. Namunalarni aralash va mos keladigan nazorat elementlari bilan har xil harorat gradientlarida inkubatsiya qilgandan so'ng, ligandga bog'langan oqsillar qizdirilgandan keyin buklangan va nisbatan barqaror bo'lib qoladi, bog'lanmagan oqsillar esa denaturatsiya tufayli ochiladi va cho'kadi. Immunoblotting yoki massa spektrometriyaga asoslangan yondashuvlar orqali eruvchan oqsilning termostabilligini keyingi tahlillari, ularning erish egri chizig'iga asoslangan holda, birikma va hujayra ichidagi oqsillar o'rtasidagi o'zaro ta'sirni tasdiqlaydi.
4. Yaqinlik xromatografiyasimaqsadli metabolitni qattiq fazali matritsaga konjugatsiya qilishni o'z ichiga oladi, u bilan o'zaro ta'sir qiluvchi protein komplekslarini ushlaydi. Keyin olingan oqsillar massa spektrometriyasi kabi usullar yordamida aniqlanadi.
5.Yuzaki plazmon rezonansi (SPR)kichik molekulalar va oqsillar o'rtasidagi o'zaro ta'sirlar bilan bog'liq kinetik parametrlarni real vaqt rejimida, tegsiz o'lchash uchun ishlatiladi.
6. Protein kristallografiyasikichik molekulali ligandlar bilan komplekslangan oqsillarning uch o'lchovli tuzilmalarini yoritib beradi, bu bog'lanish joylari va ta'sir mexanizmlari haqida intuitiv tushuncha beradi. Ushbu tuzilmalarni hal qilish orqali tadqiqotchilar to'g'ridan-to'g'ri kichik molekulalarning oqsil maqsadlari bilan qanday ta'sir qilishini tasavvur qilishlari mumkin.