Aktinik keratoz uchun Ingenol mebutatning SLC25A20 funktsional maqsadini aniqlash uchun kimyoviy proteomikadan foydalanish
Ushbu tadqiqot quyosh keratozini davolashda qo'llaniladigan makromorol metil butilat (Ing-Meb) ning yangi maqsadini ochish uchun kimyoviy proteomikadan foydalanadi. Tadqiqot guruhi dastlab Ing-Dayne nomli Ing-Meb fotoaffinlik probini ishlab chiqdi va sintez qildi, u ultrabinafsha nurlari ta'sirida maqsadli oqsillar bilan kovalent bog'lanish hosil qiladi, bu potentsial funktsional maqsadlarni aniqlashni osonlashtiradi. Keyinchalik tekshirish orqali mualliflar SLC25A20 ni Ing-Mebning asosiy maqsadi sifatida aniqladilar. SLC25A20 mitoxondriyal membrana bilan bog'langan karnitin-atsilkarnitin translokazasi bo'lib, yog 'kislotalari almashinuvida ishtirok etadi. Shunisi e'tiborga loyiqki, Ing-Mebning SLC25A20 funktsiyasiga inhibitiv ta'siri uzoq zanjirli asilkarnitinlarning to'planishini kuchaytiradi, bu esa Ing-Meb yog' kislotalarining oksidlanish yo'lini modulyatsiya qilish orqali o'zining terapevtik ta'sirini ko'rsatishini tasdiqlaydi. Bundan tashqari, tadqiqot tabiiy mahsulotlarni tekshirishda tarkibiy o'zgarishlarning ahamiyatini o'rganadi. Ing-Dayne fotoaffinlik zondini Ing-Mebning strukturaviy modifikatsiyasi orqali sintez qilish orqali tadqiqotchilar an'anaviy tushunishdan farq qiladigan yangi maqsadni muvaffaqiyatli topdilar. Bu nafaqat Ing-Meb va uning ta'sir qilish tartibini tushunishni kuchaytiradi, balki tabiiy mahsulotlarning murakkabligini ochish uchun kimyoviy proteomika tadqiqotlarida tarkibiy o'zgartirishning muhim rolini ham ta'kidlaydi. Bunday tushunchalar mavjud dori samaradorligini optimallashtirish, muayyan ob'ektlarga qaratilgan yangi davolash usullarini ishlab chiqish va dori vositalarining nojo'ya ta'siri mexanizmlarini tushuntirishni o'z ichiga olgan dori innovatsiyasini yanada kuchaytiradi.
Tadqiqot yo'nalishi
Eksperimental jarayon
1. Sintetik Ing-Dayne fotoaffinlik probini loyihalash Ing-Meb Actinic Keratosis preparatining maqsadli oqsil bilan bog'lanishi mexanizmini ochib beradi.
Ushbu tadqiqotda Actinic Keratosis terapevtik Ing-Meb preparatidan olingan Ing-Dayne Ing-affinity probi ishlatilgan (1-rasmga qarang). Ushbu zond molekulasini o'ziga xos hujayralar bilan birgalikda etishtirish va keyinchalik ultrabinafsha nurlanishi orqali prob ichidagi qo'sh akridin strukturasi hujayra ichidagi oqsillar bilan barqaror kovalent aloqalarni hosil qildi. Hujayra parchalanishidan so'ng, Click kimyoviy reaktsiyasi azid-tetrametilrodamin muxbir guruhining maqsadli oqsilga biriktirilishini osonlashtirdi (2-rasmda ko'rsatilgan). Keyingi SDS-PAGE tahlili (3-rasmda tasvirlangan) Ing-Meb probga sezilarli raqobatbardosh bog'lash ta'sirini ko'rsatdi, shunga o'xshash tuzilishga ega Ingenol esa raqobatbardosh inhibisyonni ko'rsatmadi.
1-rasm: Ing-Dayne sintezi uchun ishlatiladigan ikkita sintetik yo'lni tasvirlaydi.
2. Yangi prob 11b THP-1 hujayralari ichida BBR ning yallig'lanish bilan bog'liq 44 maqsadli oqsillarini aniqladi va EIF2AK2, eEF1A1, PRDX3 va VPS4B ni BBR bilan o'ziga xos o'zaro ta'sirga ega to'g'ridan-to'g'ri nishon sifatida aniqladi.
Mualliflar bir qator eksperimentlar orqali THP-1 hujayralari ichidagi potentsial maqsadli oqsillarni belgilash va tozalash uchun 11b yangi zonddan muvaffaqiyatli foydalanganlar. Shundan so'ng, ular molekulyar og'irligi 20 dan 80 kDa gacha bo'lgan 44 ta yallig'lanish bilan bog'liq oqsillarni aniqlash uchun LC-MS / MS tahlilidan foydalanganlar, ulardan oltitasi BBR ning yallig'lanishga qarshi ta'sirida muhim rol o'ynashi aniqlangan. Keyingi tekshiruvlarda EIF2AK2, eEF1A1, PRDX3 va VPS4B BBR ning to'g'ridan-to'g'ri maqsadlari sifatida tasdiqlandi va BBR davolashning yuqori konsentratsiyasida raqobatbardosh inhibisyon ta'sirini ko'rsatdi. Ushbu topilma ushbu oqsillar va BBR o'rtasidagi o'ziga xos o'zaro ta'sirlarning mavjudligini ochib berdi va shu bilan ularning yallig'lanishga qarshi jarayonlarida preparat bilan aloqasi haqida yangi tushunchalarni aniqladi.
2-rasm: Ing-Dayne maqsadini jelga asoslangan tekshirish jarayoni.
Shakl 3: Ing-Dayne prob molekulasida Ing-Meb va ingenolning raqobatbardosh inhibisyonu.
3. SILAC skriningi, Western blot tekshiruvi bilan birgalikda, SLC25A20 ni Ingenol sinfidagi Ing-Meb preparatining asosiy maqsadi sifatida aniqladi.
Mualliflar dastlab 28 ta potentsial maqsadli oqsillarni hujayra madaniyatida aminokislotalar (SILAC) texnologiyasi bo‘yicha barqaror izotop yorlig‘i yordamida tekshirdilar (4-rasm). Keyinchalik, keyingi skrining va Western blot tekshiruvi tajribalari (5-rasm) orqali tadqiqotchilar Ing-Meb ushbu nomzod maqsadlar orasida SLC25A20 ga eng kuchli inhibitiv ta'sir ko'rsatganligini kuzatdilar, bu SLC25A20 Ing-Mebning asosiy funktsional maqsadlaridan biri ekanligini aniq ko'rsatmoqda.
4-rasm: Dastlabki skrining natijasida olingan 28 ta potentsial maqsad.
5-rasm: to'rtta potentsial maqsadli oqsilning Western blot tajribalari.
4. Ing-Meb, SLC25A20, shuningdek, botulinum alkalilipoiltransferaza sifatida ham ma'lum bo'lgan mitoxondriyal membrana oqsilini inhibe qilish orqali yog 'kislotasi oksidlanish yo'lini tartibga soladi va shu bilan uning maqsadini Actinic Keratosis preparati sifatida ochib beradi.
Mualliflar mitoxondriyal membranada lokalizatsiya qilingan multimodal integral membrana oqsili botulinum gidroksidi lipoiltransferaza yoki CACT sifatida ham tanilgan SLC25A20 ni tekshirdilar. Uning asosiy vazifasi mitoxondriyalarga uzun zanjirli atsilkarnitinlarni tashish, ularning erkin karnitin bilan almashinuvini osonlashtirishdir. Ushbu tashilgan asilkarnitinlar keyinchalik karnitin palmitoiltransferaza-2 (CPT-2) tomonidan yog'li atsilkoA ga aylanadi va shu tariqa yog' kislotasi b-oksidlanishi uchun prekursorlar bo'lib xizmat qiladi. Eksperimental topilmalar aktinik keratoz Ing-Meb (6-rasmda tasvirlangan) kontsentratsiyasining oshishi bilan hujayralardagi uzun zanjirli asilkarnitin miqdorining sezilarli darajada oshishini aniqladi. Ushbu kuzatish Ing-Mebning SLC25A20 ga inhibitiv ta'sirini kuchli qo'llab-quvvatlaydi va shu bilan SLC25A20 Ing-Meb ta'sirida vositachilik qiluvchi asosiy maqsadlardan biri ekanligini tasdiqlaydi.
6-rasm: Ing-Mebning uzoq zanjirli asilkarnitinlarga ta'siri
5. SLC25A20 ifodasi orqali Ing-Meb sitotoksik ta'sirini bilvosita tasdiqlash: Dori vositalari faoliyatini tartibga solishda uning maqsadli funktsiyasini ochib berish.
Tadqiqotchilar HeLa hujayralarida SLC25A20 inhibisyonunu Ing-Mebning potentsial sitotoksik ta'siri bilan bevosita bog'lashga harakat qilishdi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, SLC25A20 ning haddan tashqari ekspressiyasi bu hujayralardagi Ing-Mebning yarim inhibitiv kontsentratsiyasini o'zgartirmasa ham, SLC25A20 ifodasining ortishi Ing-Mebning uzun zanjirli atsilkarnitin to'planishiga ta'sirini sezilarli darajada yumshatganligi diqqatga sazovordir (7-rasmda tasvirlangan). . Ushbu natija SLC25A20 Ing-Mebning dori faolligi uchun asosiy funktsional maqsad bo'lib xizmat qilishi haqidagi gipotezani yanada tasdiqlaydi.
7-rasm: SLC25A20 ning CC50 va asilkarnitinga ifodalanishi yoki ta'siri.
Ushbu tadqiqot nafaqat Ing-Mebning yangi maqsadlarini ochibgina qolmay, balki tarkibiy jihatdan murakkab tabiiy mahsulotlarni maqsadli kashf qilish uchun yangi nazariy asos va strategik yo'nalishni ham beradi. Malumot: