[Milliy asosiy loyihani moliyalashtirish] Metall bogʻlovchi oqsillarni ochish: METAL-TPP yutuqlari va dori-darmonlarni kashf etish innovatsiyalari
Metall bog'lovchi oqsillar metall ionlari bilan barqaror komplekslar hosil qiluvchi muhim komponentlar bo'lib, tirik organizmlarda turli xil hayotiy funktsiyalarni bajaradi, jumladan hujayra signalizatsiyasi, biokimyoviy reaktsiyalarni katalizlash va metall ionlari gomeostazini saqlash. Ularning buzilishi saraton, nevrologik kasalliklar va metabolik kasalliklar kabi kasalliklar bilan bog'liq. Kasallikning patogenezida ularning rolini tushunish diagnostika va davolashda muhim ahamiyatga ega. Bundan tashqari, metallni bog'laydigan oqsillar dori vositalarini ishlab chiqishda muhim maqsadlardir, chunki ko'plab dorilar terapevtik ta'sir ko'rsatish uchun ular bilan o'zaro ta'sir qiladi. Ushbu tadqiqotda tadqiqotchilar zamonaviy kimyoviy proteomika usuli bo'lgan METAL-TPP ni taqdim etdilar. METAL-TPP termostabillik miqdoriy proteomik tahlilini (TPP) metallni bog'laydigan oqsillarni identifikatsiyalash bilan birlashtirib, metallni bog'laydigan oqsillarni samarali va aniq aniqlash imkonini beradi. Shunisi e'tiborga loyiqki, u sof oqsillar va hujayra lizatlarini aniq aniqlashni osonlashtiradigan bir qator metall xelatatorlar yordamida oqsil termostabilligini tartibga soladi. Ushbu innovatsion yondashuv biologik tadqiqotlar, kasalliklarni tushunish va dori-darmonlarni ishlab chiqishda yordam beradigan metallni bog'laydigan oqsil funktsiyasi va mexanizmlari haqida yangi tushunchalarni taqdim etadi. Keloxi Biology farmatsevtika ilmiy-tadqiqot ishlarida ilg'or ABPP, TPP va boshqa texnik xizmatlarni taqdim etadi, tadqiqotchilarga dori mexanizmlarini o'rganishda va yangi dori vositalarini ishlab chiqish jarayonlarini ilgari surishda yordam beradi.
Eksperimental jarayon
1. METAL-TPP yordamida o'n ettita potentsial metall bog'lovchi oqsillar aniqlandi.
Dastlab, tadqiqotchilar sof oqsillar va hujayra lizatlarida EDTA yordamida keng spektrli metall xelyatsiyasining samaradorligini baholadilar. Ular METAL-TPP metallni bog'laydigan oqsillarning termal barqarorligining pasayishini samarali aniqlaganligini kuzatdilar. Keyinchalik, METAL-TPP yordamida insondan olingan oqsillar bo'yicha tizimli tahlil o'tkazildi, termostabilligi pasaygan 125 ta oqsil aniqlandi. Ularning 102 tasi ilgari ma'lum bo'lgan metall bog'lovchi oqsillar edi. Bundan tashqari, oldindan funktsional izohsiz 17 ta potentsial metallni bog'laydigan oqsillar topildi, bu metallni bog'laydigan oqsillarning roli haqida yangi tushunchalarni taklif qildi.
2. Rux ionlarining potentsial metall bog'lovchi oqsili GFPT2 ga ta'siri.
Ushbu 17 potentsial metallni bog'laydigan oqsillar orasida tadqiqotchilar GFPT2 oqsilida chuqur biokimyoviy tekshiruv o'tkazishni tanladilar. GFPT1/2 geksoza biosintezi yo'lida tezlikni cheklovchi birinchi ferment bo'lib, UDP-GlcNAc deb ataladigan moddani yaratishga yordam beradi. Tadqiqotchilar hujayra darajasida sink ionlari GFPT2 bilan o'zaro ta'sir qilishini va uning faoliyatini inhibe qilishini tasdiqladilar. Bundan tashqari, ular sink ionlarining mavjudligi UDP-GlcNAc darajasining sezilarli darajada pasayishiga olib kelishini kuzatdilar, bu sink ionlari GFPT2 faolligini inhibe qilish orqali geksoza biosintezi yo'lini boshqaradi. Qizig'i shundaki, sink ionlari GFPT2 va GFPT1 faoliyatini inhibe qilishda turli xil selektivlikni namoyish etadi, bu esa yangi tartibga solish mexanizmi mavjudligini ko'rsatadi.
3. GFPT2 va GLMS fermenti faolligi bo'yicha sink ionlarining molekulyar mexanizmini dekodlash.
Tadqiqotchilar GFPT2 oqsilining gomologini E. coli dan ajratib olishdi va bir qator biokimyoviy tajribalar va kristall struktura tahlillarini o‘tkazishdi. Topilmalar shuni ko'rsatdiki, GLMS oqsili sink ionlarini bog'lash qobiliyatiga ega va ayniqsa, bu bog'lanish substratni bog'laydigan hududga yaqin joyda sodir bo'ladi. Bu sink ionlari GLMS va GFPT2 faol joylarida bog'lanish uchun raqobatlashishi yoki ularning faol joylari bilan muvofiqlashtiruvchi aloqalarni hosil qilish orqali ikkala fermentning faolligiga to'sqinlik qilishi mumkin bo'lgan potentsial stsenariyni taklif qiladi.
4.Metal chelator TPEN sink ionini bog'lovchi oqsillarni aniq taniy oladi.
Va nihoyat, tadqiqotchilar METAL-TPP ning TPEN metall chelatoridan foydalangan holda inson oqsillarida metallni bog'laydigan oqsillarni aniqlash qobiliyatini kengaytirdilar. Eksperimental natijalar shuni ko'rsatdiki, termal barqarorligi pasaygan 150 ta oqsildan 110 tasi (73%) metallni bog'laydigan oqsillar bo'lgan, bu TPEN, EDTA kabi, metallni bog'laydigan oqsillarni aniq tanishi mumkinligini ko'rsatadi. Ular orasida ma'lum bo'lgan metall bog'lovchi oqsillarning 95 tasi (86%) rux ionini bog'lovchi oqsillar edi, EDTA tufayli termal barqarorligi pasaygan oqsillarning atigi 41% rux ionini bog'lovchi oqsillar edi, bu esa TPENning sink ionini aniqlashni afzal ko'rishini ko'rsatadi. - bog'lovchi oqsillar.
Aniqlangan 40 ta potentsial metall bog'lovchi oqsillar orasidan mualliflar dastlabki biokimyoviy tekshirish uchun bitta maqsadli protein, GPATCH11 ni tanladilar va bu protein sink ionini bog'lovchi oqsil ekanligini aniqladilar.
5. METAL-TPPda ikkita metall xelatatorni tanib olish qobiliyatini taqqoslash.
Tadqiqotchilar, shuningdek, METAL-TPP proteomikasi ma'lumotlarida termal barqarorligi pasaygan oqsillarni aniqlash uchun ikkita metall chelatator, TPEN va EDTA qobiliyatini solishtirdilar. Ikkala xelatator tomonidan aniqlangan 37 ta oqsildan 27 tasi sinkni bog'lashi ma'lum, 5 tasi boshqa metallarni bog'lashi ma'lum va 5 tasi ilgari metall bog'lovchi oqsillar sifatida izohlanmaganligini aniqladilar. Bir chelator ostida termal barqarorligi pasaygan va boshqasi ostida o'zgarmagan yoki ortgan oqsillar uchun tadqiqotchilar METAL-TPP tomonidan identifikatsiya diapazonidagi farqning ikkita mumkin bo'lgan sababini taklif qilishdi. Birinchidan, har bir xelator ba'zi oqsillarda bog'lovchi ligand sifatida harakat qilishi mumkin, bu ularni yanada barqaror qiladi va metallni bog'lashdan kelib chiqadigan beqarorlashtiruvchi ta'sirga qarshi turadi. Ikkinchidan, turli xil molekulyar tuzilmalar tufayli, ikkita chelatator ham suvda juda farq qiladi. Shunday qilib, kelajakdagi METAL-TPP tadqiqotlari metalloproteom doirasini yanada kengroq o'rganish uchun noyob molekulyar tuzilmalarga ega bo'lgan boshqa xelatatorlar yordamida amalga oshirilishi mumkin.
Umuman olganda, ushbu tadqiqot metallni bog'laydigan proteomik tadqiqotlarni o'tkazish uchun kuchli vosita bo'lib xizmat qiluvchi yangi METAL-TPP usulini taqdim etdi. Ushbu yondashuv orqali tadqiqotchilar tizimli ravishda metallni bog'laydigan oqsillarni aniqladilar va ularning biologik funktsiyalari va patogenezidagi rolini aniqladilar. Ushbu urinish nafaqat muhim ma'lumotlar bazalarini yaratadi, balki metallni bog'laydigan oqsillarning biokimyoviy funktsiyalari va dori-darmonlarni ishlab chiqish potentsialini tushunish uchun qimmatli tushunchalarni beradi va shu bilan tegishli sohalarda keyingi tadqiqotlarni rivojlantirishga yordam beradi.