Nuklein kislotasi-oqsil o'zaro ta'siri yaqinlik belgilarini belgilash strategiyasi orqali aniqlandi: G4PID problari va PLGPB strategiyasini o'rganish
Ushbu maqola mualliflar G4PID deb nomlangan yangi bifunksional zondni taqdim etadigan innovatsion tadqiqotni taqdim etadi. Ushbu prob RHAU ning G4-bog'lovchi domenini (RHAU23) miniTurbo biotin ligazasi bilan birlashtirib, G-quadruplekslarni (G4) aniq nishonga olish va jonli hujayralardagi G4 bilan o'zaro ta'sir qiluvchi oqsillarni belgilash imkonini beradi. Guaninga boy nuklein kislotalar ketma-ketligidan hosil bo'lgan G4 tuzilmalari genlarni tartibga solish, DNK replikatsiyasi va ta'mirlash kabi turli xil hujayra jarayonlarida muhim ahamiyatga ega. G4 ning ahamiyati keng tarqalgan tan olinishiga qaramay, hujayralardagi o'ziga xos mexanizmlar va ularning oqsillar bilan o'zaro ta'siri ko'p jihatdan o'rganilmagan. G4PID dan foydalangan holda, mualliflar G4 bilan o'zaro ta'sir qiluvchi oqsillarni aniq aniqlash va tahlil qilish uchun maxsus biotin yorliqlash usulini (PLGPB) ishlab chiqdilar, bu G4 tuzilmalarining hujayra funktsiyalaridagi hal qiluvchi roliga oydinlik kiritdi. Ushbu yondashuv G4 bilan o'zaro ta'sir qiluvchi 149 protein nomzodini muvaffaqiyatli aniqladi, ular asosan transkripsiyani tartibga solish, mRNKni birlashtirish va xromatinni qayta qurishda ishtirok etadilar. Etti nomzod oqsillarni tekshirish, ularning DNK G4 ga har xil yaqinliklarga ega bo'lsa-da, RNK G4 bilan bog'lanishini afzal ko'rdi. SF3B4 qo'shilish omilining batafsil o'rganilishi uning G4 tuzilmalari bilan o'zaro ta'sirini ko'rsatdi, bu muqobil qo'shilish hodisalariga ta'sir qiladi. G4 tuzilmalarining barqarorlashuvi SF3B4 ning bog'lanish samaradorligini o'zgartirdi va o'ziga xos genlarning (masalan, INPPL1 va PPP6R2) muqobil biriktirilishiga ta'sir qildi.
Yallig'lanishga qarshi, gipoglikemiya va yurak-qon tomir himoyasi kabi keng ko'lamli farmakologik ta'sirga ega an'anaviy alkaloid bo'lgan berberin katta e'tiborni tortdi. Biroq, uning aniq molekulyar mexanizmlari, ayniqsa yallig'lanishni bostirishda, noaniqligicha qolmoqda.
Ushbu tadqiqot EIF2AK2 ni yallig'lanishga qarshi ta'siri uchun berberin tomonidan jalb qilingan muhim maqsad sifatida aniqlash uchun ABPP texnologiyasidan foydalangan holda ushbu bilim bo'shlig'ini to'ldiradi. Topilmalar berberin mexanizmi haqidagi tushunchamizni chuqurlashtiradi va berberinni qayta joylashtirish va yangi EIF2AK2 yallig'lanishga qarshi dorilarni ishlab chiqish uchun ilmiy asos beradi.
Jamoa berberinning hujayra ichidagi oqsillar bilan o'zaro ta'sirini muntazam ravishda o'rganish uchun ilg'or kimyoproteomik usullardan foydalangan, bu uning EIF2AK2 bilan o'ziga xos bog'lanishini va uning fermentativ faolligini modulyatsiya qilishni tasdiqlagan. Bu yallig'lanishga qarshi javob yo'llariga ta'sir qiladi, yallig'lanish rivojlanishini samarali ravishda inhibe qiladi. Ushbu muhim yutuq berberinning yallig'lanishga qarshi mexanizmi haqida tushuncha beradi va EIF2AK2 ga qaratilgan yangi davolash usullarini ishlab chiqishni qo'llab-quvvatlaydi.
ChomiX tadqiqotchilarga dori mexanizmlarini oʻrganishda va yangi dori vositalarini ishlab chiqish boʻyicha saʼy-harakatlarni tezlashtirishda yordam berish uchun ABPP va CETSA kabi ilgʻor xizmatlarni taqdim etadi.
Tadqiqot yo'nalishi
Eksperimental jarayon
1. G4PID probining konstruksiyasi va o'ziga xosligini tekshirish.
Mualliflar dastlab G4-bog'lovchi RHAU23 domeni N-terminusda va miniTurbo C-terminusda joylashgan bo'lib, moslashuvchan bog'lovchi bilan bog'langan G4PID probini yaratdilar. Ekspressiya va tozalash BL21 (DE3) shtammi yordamida amalga oshirildi. Tozalangan G4PID bilan bog‘lanishni tekshirish bo‘yicha o‘ziga xos tajribalar uning BCL2 G4 bilan aniq bog‘lanishini ko‘rsatdi, Kd qiymati 15 ± 7 nM bo‘lib, boshqa G4 bo‘lmagan tuzilmalarga nisbatan ahamiyatsiz yaqinlik ko‘rsatdi. Bundan tashqari, mualliflar G4-o'zaro ta'sir qiluvchi oqsillarni tanlab biotinillash qobiliyatini ko'rsatib, G4PID ning biotinillanish o'ziga xosligini baholadilar.
1-rasm G4 PID G 4 o'zaro ta'sir qiluvchi oqsilning o'ziga xos biotinilatsiyasiga vositachilik qiladi
2. Hujayralarda G4PID ning RNK G4 bilan bog'lanish qobiliyati va biotin yorliqlash xususiyatlari.
Mualliflar HA-G4PID va HA-miniTurbo HeLa hujayra liniyalarini eCLIP eksperimentlari orqali G4PID ning hujayra ichidagi RNK G4 bilan bog'lanishini o'rganish uchun yaratdilar. Natijalar G4PID ning RNK G4 bilan selektiv o'zaro ta'sirini ko'rsatadi, bu tasodifiy ketma-ketliklarga nisbatan PQS o'z ichiga olgan RNK ketma-ketliklariga sezilarli darajada yuqori bog'lanishni ko'rsatadi. Bundan tashqari, mualliflar G4PID ning o'ziga xos xususiyatlarini kuzatdilar, bu kofaktorlarni talab qilmasdan hujayralar ichida biotin belgilarini boshlashni osonlashtiradi. Bu 30 daqiqa ichida G4PID uchun aniq biotinilatsiya signallari aniqlangan, bu miniTurbo bilan solishtirganda tezroq yorliqlash kinetikasini ko'rsatib, oqsil yorlig'i samaradorligini sezilarli darajada oshirishga olib keldi.
2-rasm G 4 PID RNK G4 tajribalari va HEK293T hujayralarida etiketkalash samaradorligini optimallashtirish bilan birlashtirilgan.
3. PLGPB usuli yordamida hujayra ichidagi G4 o'zaro ta'sir qiluvchi proteomani qo'lga olish va aniqlash.
Keyinchalik, mualliflar G4-o'zaro ta'sir qiluvchi oqsillarning yaqinlik yorlig'i (PLGPB) yondashuvidan foydalangan holda jonli hujayralardagi G4 o'zaro ta'sir qiluvchi proteomani qo'lga olish va aniqlash uchun G4PID probidan foydalanganlar. 578 ta oqsilni o'z ichiga olgan uchta mustaqil takroriy tajribada 80% identifikatsiyaga erishildi, HEK293T hujayralarida G4PID va miniTurbo bilan transfeksiya o'tkazildi. Skrining natijasida G4 bilan o'zaro aloqada bo'lgan 149 ta nomzod oqsil aniqlandi, ular G4 bilan o'zaro ta'sir qiluvchi oqsillarning mavjud ma'lumotlar bazalari bilan sezilarli darajada mos keladi. Bundan tashqari, Gen Ontologiyasi (GO) boyitish tahlili G4 tadqiqotidagi oldingi topilmalarga mos keladigan ushbu oqsillarning transkripsiya regulyatsiyasi, mRNKni birlashtirish va xromatinni qayta qurish bilan muhim bog'liqligini ko'rsatdi.
Shakl 3 PLGPB usuli bilan G4 bilan o'zaro ta'sir qiluvchi oqsillarni aniqladi.
4. Yangi identifikatsiya qilingan nomzodlarda G4 bog'lovchi yaqinligini tekshirish.
PLGPB usuli orqali mualliflar turli funktsional toifalarni, jumladan, umumiy telomerlar bilan bog'langan oqsillarni, transkripsiya omillarini va nisbatan kam uchraydigan oqsillarni bog'laydigan oqsillarni o'z ichiga olgan bir qator nomzodlarni topdilar. Bu shuni ko'rsatadiki, PLGPB usuli nafaqat ilgari tan olingan G4 o'zaro ta'sir qiluvchi oqsillarni tasdiqlaydi, balki turli funktsional sinflarni qamrab oluvchi yangi nomzodlarni ochib, oqsil landshaftini sezilarli darajada kengaytiradi. Bundan tashqari, mualliflar ushbu nomzodlarning RNK G4 va DNK G4 bilan bog'lanish qobiliyatini tasdiqladilar, bu RNK G4 uchun aniq afzallik va turli xil konformatsiyalarda DNK G4 ga yaqinlikdagi o'zgarishlarni aniqladi. Ushbu topilmalar G4 konformatsiyasini tartibga solish orqali protein-G4 o'zaro ta'sirini modulyatsiya qilish potentsialini ta'kidlaydi.
4-rasm Nomzod oqsillar bilan RNK G4 va DNK G4 o'rtasidagi o'zaro ta'sir.
5. SF3B4 va G4 tuzilmalarining yuqori ishonchli bog'lanish joylarini aniqlash.
G4 ulanishining in vivo rejimini o'rganish davomida mualliflar SF3B4 oqsilining muhim rolini aniqladilar. SF3B4, RNK qo'shilishida ishtirok etishi bilan mashhur, eCLIP tajribalari va rG4-seq va DMS-seq ma'lumotlarini har tomonlama tahlil qilish orqali aniqlangan yuqori ishonchli bog'lanish joylariga ega edi. Ushbu bog'lanish joylarining taxminan yarmida asosan noan'anaviy G4 tuzilmalari bilan bog'liq bo'lgan PQS mavjud. Bundan tashqari, mualliflar SF3B4 bog'lanish joylari va RNK PQS o'rtasidagi yaqin fazoviy aloqani kuzatdilar, bu asosan intronik hududlarda, ayniqsa 3' qo'shilish joyiga proksimalda boyitilgan taqsimotga ega. Ushbu topilmalar SF3B4 va G4 tuzilishi o'rtasidagi o'zaro ta'sir muqobil biriktirish mexanizmlarida hal qiluvchi rol o'ynashi mumkinligini aniq ko'rsatmoqda.
5-rasmda eCLIP texnologiyasidan foydalangan holda hujayralardagi SF3B4 ning G4 ulanish afzalligi aniqlangan.
6. G4 tuzilmasi SF3B4 vositachiligida muqobil qo'shishni tartibga soladi.
Mualliflar SF3B4 bog'lanish joylarini tahlil qilishdi va uning G4 tuzilishi bilan bog'liqligini aniqlashdi va muqobil qo'shilish hodisalarida uning tartibga solish mexanizmini qo'shimcha tekshirishdi. Muqobil birlashma bilan bog'liq bo'lgan an'anaviy PQS batafsil tekshirish uchun tanlangan ikkita gen, INPPL1 va PPP6R2 bilan tekshirildi. G4-INPPL1 va G4-PPP6R2 deb ataladigan INPPL1 va PPP6R2 tarkibidagi G4 tuzilmalari tasdiqlandi va SF3B4 ushbu G4 tuzilmalariga maxsus bog'lovchi sifatida aniqlandi. Bundan tashqari, G4 ligand piridostatin (PDS) qo'shilishi SF3B4 ning G4 tuzilmalari bilan bog'lanishini susaytirishi, natijada INPPL1 va PPP6R2 mRNK birlashmasi paytida ekson qo'shilish hodisalarini rag'batlantirishi ko'rsatildi. Ushbu topilmalar G4 strukturasining SF3B4 vositachiligidagi muqobil birlashmadagi potentsial ahamiyatini ko'rsatadi.
6-rasm SF3B4 G4 strukturasini bog'laydi va mRNKning muqobil biriktirilishiga ta'sir qiladi.
Xulosa qilib aytganda, ushbu tadqiqot G4PID probi va PLGPB strategiyasini o'z ichiga olgan samarali vositalar to'plamini taqdim etadi, bu G4 va hujayra ichidagi oqsillar o'rtasidagi o'zaro ta'sir gen ekspressiyasiga qanday ta'sir qilishiga, xususan, muqobil birlashmaning asosiy jarayoniga ta'sir qiladi. Ushbu topilmalar hujayrali biologik jarayonlarda G4 ni o'z ichiga olgan tartibga solish mexanizmlarini tushunishimizni chuqurlashtiradi va G4 bilan bog'liq kasalliklar uchun terapevtik strategiyalarni yanada o'rganishga yo'l ochadi.