Kichik molekula WA sirini ochish: PHGDH fermentini tartibga solishga yorug'lik berish va saratonga qarshi yangi davolash usullariga yo'l ochish
Serin ajralmas aminokislota bo'lib, tirik organizmlarda turli muhim biologik funktsiyalarni bajaradi. U nafaqat oqsil sintezining asosiy komponenti bo'libgina qolmay, balki nukleotidlar sintezi, metionin almashinuvi va antioksidant funktsiyalarni o'z ichiga olgan ko'plab metabolik yo'llarni tartibga solishda ishtirok etadi. Ushbu yo'llar orasida fosfopiruvat dehidrogenaza (PHGDH) muhim ahamiyatga ega, chunki u 3-fosfogliseratni 3-fosfogidroksipiruvatga aylantirib, serin sintezi yo'lining dastlabki bosqichini katalizlaydi. Uning serin metabolizmidagi markaziy rolini hisobga olgan holda, PHGDH funktsiyasidagi har qanday aberatsiya ko'plab kasalliklarning, xususan, saratonning boshlanishi va rivojlanishi bilan chambarchas bog'liq.
Ushbu maqola PHGDH ni kovalent tarzda inhibe qila oladigan birikmani aniqlash uchun kimyoviy proteomika va fenotipik tahlil usullaridan foydalanadigan innovatsion yondashuvni taqdim etadi. Ko'pgina PHGDH inhibitörleri odatda raqobatbardosh bo'lsa-da, mualliflar tabiiy kichik molekula bo'lgan Withangulin A (WA) ni PHGDH ning yangi kovalent inhibitori sifatida taqdim etadilar. WA PHGDH inhibitörlerini ishlab chiqish uchun istiqbolli etakchi birikma sifatida paydo bo'ladi. Bundan tashqari, WA PHGDH va serin sintez yo'lini (SSP) funksionalligini tekshirish uchun qimmatli tadqiqot bo'lib xizmat qiladi. Ushbu inhibitordan foydalanib, tadqiqotchilar serin metabolizmini boshqaruvchi tartibga solish mexanizmlari haqida chuqurroq tushunchaga ega bo'ladilar va shu bilan bog'liq kasalliklarni, xususan, saratonni davolashning potentsial usullarini o'rganish uchun yo'l ochadilar.
Ushbu kashfiyot nafaqat dori-darmonlarni davolashning yangi strategiyalarini ishlab chiqish uchun istiqbolli yo'nalishlarni taklif qiladi, balki kasallikning rivojlanishida serin metabolizmining roli haqida muhim tushunchalarni beradi.
Tadqiqot yo'nalishi
Eksperimental jarayon
1. Sitotoksiklik tajribalarida WP va WA ni solishtirish.
Tadqiqotda muallif WP deb nomlangan murakkab zondni ishlab chiqdi va sintez qildi. Inson yo'g'on ichak saratoni hujayralarini (HCT-116) va oddiy yo'g'on ichak hujayralarini (NCM460) ishlatib, mualliflar WP WA bilan taqqoslanadigan sitotoksiklikni ko'rsatishini kuzatdilar. Bu alkin belgilarining kiritilishi uning sitotoksik ta'sirini sezilarli darajada o'zgartirmaganligini ko'rsatadi. Bundan tashqari, mualliflar WA normal yo'g'on ichak hujayralarida past sitotoksiklikni, ammo yo'g'on ichak saratoni hujayralarida yuqori sitotoksiklikni ko'rsatishini ta'kidladilar, bu uning yo'g'on ichak saratoni hujayralariga nisbatan selektivligini ta'kidladi.
Keyinchalik, mualliflar HCT-116 hujayralarida WP probidan foydalangan holda Faollikka asoslangan protein profilini yaratish (ABPP) strategiyasidan foydalanishdi. Ushbu yondashuv PHGDH ni WA ning bevosita maqsadli oqsili sifatida aniqlashga olib keldi. Eksperimental tekshirish natijalarini tasdiqlovchi WB-pull-down tahlillari yordamida amalga oshirildi.
Shakl 1: Withangulin A maqsadlarini aniqlash uchun kimyoviy proteomika yondashuvi.
2. WA va PHGDH o'rtasidagi bevosita o'zaro ta'sirni tasdiqlash.
Faoliyatga asoslangan oqsil profilini yaratish (ABPP) texnologiyasidan foydalangan holda, mualliflar PHGDH ni HCT-116 hujayralarida WA birikmasining bevosita nishoni sifatida aniqladilar. WA va PHGDH o'rtasidagi o'zaro ta'sirni tasdiqlash uchun mualliflar Drug Affinity Responsive Target Stability (DARTS) va Cellular Thermal Shift Assay (CETSA) tajribalarini o'tkazdilar. Natijalar shuni ko'rsatdiki, WA PHGDH ning termal barqarorligini oshirdi va uning faolligini sezilarli darajada inhibe qildi. Bundan tashqari, Biolayer Interferometry (BLI) tajribalari WA va PHGDH o'rtasidagi to'g'ridan-to'g'ri o'zaro ta'sirni qo'shimcha tasdiqladi.
Mualliflar, shuningdek, WA ning PHGDH bilan bog'lanishining qaytarilmas tabiatini ham tekshirdilar. Ularning tajribalari shuni ko'rsatdiki, PHGDH WP ulanishini oldini oladi; ammo N-asetil sistein (NAC) yoki glutation (GSH) o'z ichiga olgan eritmalar bilan preinkubatsiya WP ning PHGDH bilan bog'lanishini teskari qilishi mumkin. Ushbu topilmalar PHGDH oqsilidagi WA va sistein qoldiqlari o'rtasida qaytarilmas kovalent bog'lanishni ko'rsatadi.
2-rasm: WA to'g'ridan-to'g'ri PHGDH bilan bog'lanadi.
3. WA a - b - to'yinmagan keton qismi orqali PHGDH bilan kovalent bog'lanadi.
WA ning PHGDH bilan o'zaro ta'sir qilish mexanizmini yanada tushuntirish uchun tadqiqotchilar a-b-to'yinmagan keton tuzilishi orqali WA ning PHGDH bilan kovalent bog'lanishini tasdiqlash uchun tajribalar o'tkazdilar. Dastlab, WA ning a,b-to'yinmagan keton parchalari WA-1 hosil qilish uchun qisqartirildi (3A-rasmga qarang). Hujayralarni hisoblash to'plami-8 (CCK-8) tahlillari va pastga tushiriladigan oqsillar bilan o'zaro ta'sir tahlillari (3B-rasmga qarang) yordamida keyingi tahlillar WA ning sitotoksik ta'siri haqiqatan ham uning a va b-to'yinmagan keton tuzilishiga bog'liqligini ko'rsatdi. Aksincha, WA-1 PHGDH ning WP ga ulanishini samarali tarzda oldini ololmadi (3C va D-rasmga qarang), shu bilan b-to'yinmagan ketonning PHGDH bilan kovalent bog'lanishini tasdiqlaydi (3E-rasmga qarang).
O'simta hujayralarida serin sintez yo'li (SSP) jarayonlarini blokirovka qilishda PHGDH inhibisyonu yoki yo'qligi muhim rolini hisobga olgan holda, mualliflar U-13C-glyukoza barqaror izotop belgilaridan foydalangan holda HCT-116 hujayralarida WA ning SSP faolligiga ta'sirini o'rganishga kirishdilar (qarang. 3J-rasmga). Tajriba natijalari shuni ko'rsatdiki, WA HCT-116 hujayralarida SSP faolligini samarali ravishda inhibe qilgan.
3-rasm: WA PHGDH bilan kovalent bog'lanadi va PHGDH faolligini inhibe qiladi.
4. PHGDH ning Cys295 qoldig'i WA bilan kovalent bog'langan.
Nazariy jihatdan, WA ning a va b-to'yinmagan keton qismlari oqsilning sistein qoldiqlari bilan kovalent bog'lanish hosil qilishi mumkin. Haqiqatan ham, mualliflar WA tomonidan PHGDHdagi Cys295 qoldiqlarining kovalent modifikatsiyasini kuzatdilar. Keyinchalik, ular WA ning PHGDH ning Cys295 qoldiqlari bilan kovalent bog'lanishining qo'shimcha dalillarini taqdim etdilar va Cys295 da mutatsiyalar WA ning PHGDHdagi inhibitiv faolligini sezilarli darajada kamaytirishini ko'rsatdilar. Bundan tashqari, Biolayer Interferometry (BLI) tajribalari WA va rekombinant Cys295A PHGDH oqsili o'rtasida hech qanday o'zaro ta'sir ko'rsatmadi, bu WA ning PHGDH bilan tanlab kovalent bog'lanishini tasdiqladi.
Bundan tashqari, molekulyar dinamika simulyatsiyalari shuni ko'rsatdiki, WA PHGDH ning allosterik regulyatori sifatida ishlaydi, Cys295 qoldig'i potentsial ravishda PHGDH uchun yangi allosterik sayt bo'lib xizmat qiladi.
Shakl 4. WA PHGDH ning Cys295 qoldiqlari bilan tanlab kovalent bog'lanadi.
5-rasm: Cys295 qoldig'i PHGDH ning allosterik tartibga soluvchi sayti sifatida
5. WA ning HCT-116 hujayralarida redoks balansiga ta'siri.
Serin sintezi yo'li (SSP) glutation (GSH) sintezi va redoks reaktsiyalari uchun zarur bo'lgan NADPH ishlab chiqarish uchun prekursorlarni ta'minlash orqali hujayradagi redoks muvozanatini saqlashda hal qiluvchi rol o'ynaydi. Mualliflar WA ning HCT-116 hujayralarida oksidlanish-qaytarilish balansiga ta'sirini o'rganib chiqdilar va WA reaktiv kislorod turlarining (ROS) ko'payishiga olib kelishini, natijada GSH / GSSG va NADPH / NADP + nisbatlarini kamaytirishini kuzatdilar, bu esa oksidlovchi stressning kuchayganligini ko'rsatadi.
Western blot tahlili g H2AX, Cleaved caspase3 va bo'lingan PARP ning ko'tarilgan ifodasini, shuningdek, CHK2 va siklin D1 ekspressiyasining pasayishini aniqladi, bu WA tomonidan apoptozning induksiyasini ko'rsatadi. Bundan tashqari, PHGDH ning yo'qolishi ROS ishlab chiqarishning ko'payishiga olib keldi, HCT-116 hujayralarining ko'payishini inhibe qildi va PHGDH ifodasi past bo'lgan hujayralarda WA ning sitotoksikligini kamaytiradi. Ushbu topilmalar ROS ishlab chiqarishda PHGDH rolini va HCT-116 hujayralarida WA vositachiligidagi sitotoksiklikni ta'kidlaydi.
6-rasm: WA HCT-116 hujayralarida hujayra ichidagi ROS darajasini oshiradi
6. Xenograft modellarida hujayra proliferatsiyasi effekti.
WA ning HCT-116 hujayralarining in vivo ko'payishiga ta'sirini baholash uchun mualliflar HCT-116 hujayralaridan foydalangan holda ksenograft modelini yaratdilar. Natijalar shuni ko'rsatdiki, WA tana vazniga yoki organ morfologiyasiga sezilarli ta'sir ko'rsatmaydi, bu past toksiklikni ko'rsatadi.
PHGDH inhibisyonu uchun WA ning selektivligini qo'shimcha tekshirish uchun mualliflar PHGDH nokaut (KO) HCT116 hujayralaridan foydalangan holda ksenograft modelini yaratdilar. Ushbu modelda PHGDH yo'qligi HCT-116 hujayra proliferatsiyasini sezilarli darajada inhibe qildi (7-rasmga qarang, AC). Bundan tashqari, hujayra proliferatsiyasining belgisi bo'lgan Ki67 ifodasi PHGDH KO HCT116 hujayrali ksenograft modelida sezilarli darajada kamaydi (7-rasm, D ga qarang).
Ta'kidlash joizki, PHGDH KO HCT-116 hujayralaridan foydalangan holda ksenograft modelida WA hujayra proliferatsiyasiga sezilarli inhibitiv ta'sir ko'rsatmadi (7-rasm, EG ga qarang), bu WA ning HCT-116 hujayralariga inhibitiv ta'siri PHGDHga bog'liqligini tasdiqladi.
7-rasm: WA ning in vivo PHGDH KO HCT-116 hujayralarining ko'payishiga ta'siri
Ushbu tadqiqot natijalari nafaqat PHGDH uchun kelajakdagi saratonga qarshi dori ishlab chiqish uchun asosiy maslahatlar beradi, balki saraton terapiyasi sohasida yangi dori ishlab chiqish uchun yangi umid va potentsial olib keladi.