傳統醫學治療新前景：ABPP技術揭曉小檁鹼新型抗發炎標靶EIF2AK2
隨著基於活性的蛋白質分析 (ABPP) 等先進技術揭示了以前未知的治療機制，傳統醫學正在透過新的藥理學應用重新煥發活力。在此背景下，ABPP技術最近揭示了小檜鹼的一種新型抗發炎靶點，小檜鹼是一種從傳統中藥植物中提取的化合物，在中國俗稱黃連或黃連。這項發現凸顯了 EIF2AK2 作為小檜鹼抗發炎作用的關鍵角色，為其治療發炎相關疾病開闢了新途徑。這項突破凸顯了透過現代科學方法重新利用和優化傳統藥物的潛力。
小檁鹼是一種傳統的生物鹼，具有抗發炎、降血糖、保護心血管等廣泛的藥理作用，引起了人們的廣泛關注。然而，其精確的分子機制，特別是在發炎抑制方面，仍不清楚。
本研究利用 ABPP 技術填補了這一知識空白，將 EIF2AK2 識別為小檁鹼發揮抗發炎作用的關鍵標靶。這項研究結果加深了我們對小檜鹼作用機制的認識，為重新定位小檜鹼和開發新型針對EIF2AK2的抗發炎藥物提供了科學依據。
團隊採用先進的化學蛋白質體學方法系統地研究小檜鹼與細胞內蛋白質的相互作用，確認其與 EIF2AK2 的特異性結合及其酶活性的調節。這會影響發炎反應途徑，有效抑制發炎進展。這項重大突破提供了對小蘗鹼抗發炎機制的深入了解，並支持針對 EIF2AK2 的新型療法的開發。
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研究路線
實驗過程
1. 探針11b被用作蛋白質體學研究的功能工具。
作者合成並篩選了 LPS + 尼日利亞菌素活化的 THP-1 巨噬細胞中含有二苯甲醯基的新型 BBR 光親和探針。其中，化合物 7a 和 11b 對 IL-1β 表達表現出時間和劑量依賴性的抑製作用，與母體化合物 BBR 相比，顯示出增強的功效。透過基於活性的蛋白質分析（ABPP）分析和螢光掃描，證實7a和11b均有效結合其標靶蛋白並表現出競爭性抑制，從而顯示其作用機制類似於BBR。觀察到化合物11b在2.5%~25%濃度範圍內螢光強度有明顯變化，特別是在20毫摩爾濃度下螢光訊號變化最為顯著，因此選擇其作為蛋白質體學研究的功能探針。這種選擇基於其卓越的反應能力，這使其適合闡明蛋白質組環境中的蛋白質相互作用。
圖 1：BBR 探針的篩選與評估。
2.新型探針11b鑑定了THP-1細胞內BBR的44個發炎相關標靶蛋白，並揭示了EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3和VPS4B是與BBR具有特異性相互作用的直接靶點。
作者透過一系列實驗，成功地利用新型探針11b來標記和純化THP-1細胞內的潛在標靶蛋白。隨後，他們利用 LC-MS/MS 分析鑑定了 44 種分子量範圍為 20 至 80 kDa 的發炎相關蛋白，其中 6 種被發現可能在 BBR 的抗發炎作用中發揮關鍵作用。進一步研究中，EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3和VPS4B被證實是BBR的直接標靶，在高濃度BBR處理下表現出競爭性抑製作用。這項發現揭示了這些蛋白質和 BBR 之間可能存在的特定相互作用，從而闡明了它們在抗發炎過程中與藥物相互作用的新見解。
圖 2：目標蛋白捕獲和功能分析。
3.結構生物學研究闡明BBR如何調節EIF2AK2二聚化，透過關鍵離子相互作用和陽離子-pi結合發揮其抗發炎作用。
作者採用 CETSA、SPR 和分子對接技術來驗證 HEK-293 細胞中 BBR 與四種蛋白質（EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3 和 VPS4B）之間的相互作用。結果表明，BBR 提高了這四種蛋白的熱穩定性，其中對 EIF2AK2 的親和力最強。進一步研究發現，BBR與EIF2AK2的結合主要依賴於腔II中涉及D316和E367的離子對，以及與K291的陽離子-π相互作用。此結合位點參與 EIF2AK2 二聚化，顯示 BBR 可能透過調節 EIF2AK2 二聚化發揮其抗發炎作用。
圖 3：BBR 與其潛在目標之間的親和力研究。
4. BBR 在發炎和脂質代謝途徑中的作用被揭示，因為它抑制EIF2AK2 二聚體化和磷酸化，從而證明了在調節NLRP3 發炎小體、NF-kB p65/JNK/SIRT1 訊號傳導中的關鍵功能。
免疫沉澱實驗證實BBR抑制EIF2AK2二聚化，影響EIF2AK2自體磷酸化及其底物eIF2a的磷酸化，從而揭示BBR調節NLRP3發炎小體、NF-kB p65、JNK訊號路徑和SIRT1表達，在細胞發炎反應中發揮至關重要的作用。此外，沉默或過度表現EIF2AK2顯著改變了BBR對p-JNK和SIRT1的調節作用，進一步證實BBR透過與EIF2AK2結合來調節發炎相關的脂質代謝紊亂。
圖 2 目標蛋白捕獲和功能分析。
5. BBR透過標靶EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3和VPS4B，調節多種發炎通路，其中EIF2AK2在這些標靶中發揮主導調節作用。
為了進一步探索這種相互作用，作者建立了四種蛋白的過度表現和敲低模型，證明BBR 選擇性調節JNK、NF-kB、MAPK 和AKT 發炎通路，其中EIF2AK2 起主導作用，這在體內實驗中得到了驗證。
圖 5：BBR 標靶蛋白的功能研究
6. BBR透過特異性靶向EIF2AK2，下調體內IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α的分泌； EIF2AK2 基因的敲除會降低其抗發炎功效和肝臟保護作用。
然後，他們研究了 BBR 是否透過體內靶向 EIF2AK2 影響 IL-1β、IL-6、IL-18 和 TNF-α 的釋放。為此，他們透過靜脈注射攜帶 shEIF2AK2 的腺相關病毒 (AAV) 創建了 EIF2AK2 基因敲除小鼠模型。野生型和 EIF2AK2 敲除小鼠腹腔內注射 BBR (3 mg/kg)，然後注射 LPS。雖然 BBR 顯著降低對照組中 IL-1β、IL-6、IL-18 和 TNF-α 的水平，但這種作用在 EIF2AK2 敲除組中減弱。透過肝組織 H&E 染色進行的組織學檢查表明，BBR 對 EIF2AK2 敲除小鼠肝臟發炎浸潤的改善作用減弱。這些發現表明，BBR 透過靶向 EIF2AK2 可能下調 IL-1β、IL-6、IL-18 和 TNF-α 的分泌，並顯示出良好的安全性。
圖 6：EIF2AK2 體內功能驗證。
該研究充分展示了ABPP技術在闡明小檁鹼等生物活性分子複雜機制方面的強大優勢，推動了現代傳統藥物研究的進步。透過發現老藥小檜鹼的新標靶和作用機制，不僅豐富了我們對傳統藥物生物學功能的認識，也為發炎相關疾病的治療開闢了新的視角和可能性。這項成果預示著，在ABPP等現代科學技術的支持下，更多的傳統藥物將透過明確其特定標靶和作用機製而被重新利用，為人類健康事業做出重大貢獻。