传统医学治疗新前景：ABPP技术揭晓小檗碱新型抗炎靶点EIF2AK2
随着基于活性的蛋白质分析 (ABPP) 等先进技术揭示了以前未知的治疗机制，传统医学正在通过新的药理学应用重新焕发活力。在此背景下，ABPP技术最近揭示了小檗碱的一种新型抗炎靶点，小檗碱是一种从传统中药植物中提取的化合物，在中国俗称黄连或黄连。这一发现凸显了 EIF2AK2 作为小檗碱抗炎作用的关键角色，为其治疗炎症相关疾病开辟了新途径。这一突破凸显了通过现代科学方法重新利用和优化传统药物的潜力。
小檗碱是一种传统的生物碱，具有抗炎、降血糖、保护心血管等广泛的药理作用，引起了人们的广泛关注。然而，其精确的分子机制，特别是在炎症抑制方面，仍不清楚。
本研究利用 ABPP 技术填补了这一知识空白，将 EIF2AK2 识别为小檗碱发挥抗炎作用的关键靶点。该研究结果加深了我们对小檗碱作用机制的认识，为重新定位小檗碱和开发新型针对EIF2AK2的抗炎药物提供了科学依据。
该团队采用先进的化学蛋白质组学方法系统地研究小檗碱与细胞内蛋白质的相互作用，确认其与 EIF2AK2 的特异性结合及其酶活性的调节。这会影响炎症反应途径，有效抑制炎症进展。这一重大突破提供了对小檗碱抗炎机制的深入了解，并支持针对 EIF2AK2 的新型疗法的开发。
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研究路线
实验过程
1. 探针11b被用作蛋白质组学研究的功能工具。
作者合成并筛选了 LPS + 尼日利亚菌素激活的 THP-1 巨噬细胞中含有二苯甲酰基的新型 BBR 光亲和探针。其中，化合物 7a 和 11b 对 IL-1β 表达表现出时间和剂量依赖性的抑制作用，与母体化合物 BBR 相比，显示出增强的功效。通过基于活性的蛋白质分析（ABPP）分析和荧光扫描，证实7a和11b均有效结合其靶蛋白并表现出竞争性抑制，从而表明其作用机制类似于BBR。观察到化合物11b在2.5%~25%浓度范围内荧光强度发生明显变化，特别是在20毫摩尔浓度下荧光信号变化最为显着，因此选择其作为蛋白质组学研究的功能探针。这种选择基于其卓越的响应能力，这使其适合阐明蛋白质组环境中的蛋白质相互作用。
图 1：BBR 探针的筛选和评估。
2.新型探针11b鉴定了THP-1细胞内BBR的44个炎症相关靶蛋白，并揭示了EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3和VPS4B是与BBR具有特异性相互作用的直接靶点。
作者通过一系列实验，成功地利用新型探针11b来标记和纯化THP-1细胞内的潜在靶蛋白。随后，他们利用 LC-MS/MS 分析鉴定了 44 种分子量范围为 20 至 80 kDa 的炎症相关蛋白，其中 6 种被发现可能在 BBR 的抗炎作用中发挥关键作用。进一步研究中，EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3和VPS4B被证实是BBR的直接靶标，在高浓度BBR处理下表现出竞争性抑制作用。这一发现揭示了这些蛋白质和 BBR 之间可能存在的特定相互作用，从而阐明了它们在抗炎过程中与药物相互作用的新见解。
图 2：目标蛋白捕获和功能分析。
3.结构生物学研究阐明BBR如何调节EIF2AK2二聚化，通过关键离子相互作用和阳离子-pi结合发挥其抗炎作用。
作者采用 CETSA、SPR 和分子对接技术来验证 HEK-293 细胞中 BBR 与四种蛋白质（EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3 和 VPS4B）之间的相互作用。结果表明，BBR 提高了这四种蛋白的热稳定性，其中对 EIF2AK2 的亲和力最强。进一步研究发现，BBR与EIF2AK2的结合主要依赖于腔II中涉及D316和E367的离子对，以及与K291的阳离子-π相互作用。该结合位点参与 EIF2AK2 二聚化，表明 BBR 可能通过调节 EIF2AK2 二聚化发挥其抗炎作用。
图 3：BBR 与其潜在目标之间的亲和力研究。
4. BBR 在炎症和脂质代谢途径中的作用被揭示，因为它抑制 EIF2AK2 二聚化和磷酸化，从而证明了在调节 NLRP3 炎症小体、NF-kB p65/JNK/SIRT1 信号传导中的关键功能。
免疫沉淀实验证实BBR抑制EIF2AK2二聚化，影响EIF2AK2自身磷酸化及其底物eIF2a的磷酸化，从而揭示BBR调节NLRP3炎症小体、NF-kB p65、JNK信号通路和SIRT1表达，在细胞炎症反应中发挥至关重要的作用。大脑抗炎机制（例如阿尔茨海默病）和脂肪酸诱导的内质网状应激。此外，沉默或过度表达EIF2AK2显着改变了BBR对p-JNK和SIRT1的调节作用，进一步证实BBR通过与EIF2AK2结合来调节炎症相关的脂质代谢紊乱。
图 2 目标蛋白捕获和功能分析。
5. BBR通过靶向EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3和VPS4B，调节多种炎症通路，其中EIF2AK2在这些靶点中发挥主导调节作用。
为了进一步探索这种相互作用，作者建立了四种蛋白的过表达和敲低模型，证明 BBR 选择性调节 JNK、NF-kB、MAPK 和 AKT 炎症通路，其中 EIF2AK2 起主导作用，这在体内实验中得到了验证。
图 5：BBR 靶蛋白的功能研究
6. BBR通过特异性靶向EIF2AK2，下调体内IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α的分泌； EIF2AK2 基因的敲除会降低其抗炎功效和肝脏保护作用。
然后，他们研究了 BBR 是否通过体内靶向 EIF2AK2 影响 IL-1β、IL-6、IL-18 和 TNF-α 的释放。为此，他们通过静脉注射携带 shEIF2AK2 的腺相关病毒 (AAV) 创建了 EIF2AK2 基因敲除小鼠模型。野生型和 EIF2AK2 敲除小鼠腹膜内注射 BBR (3 mg/kg)，然后注射 LPS。虽然 BBR 显着降低对照组中 IL-1β、IL-6、IL-18 和 TNF-α 的水平，但这种作用在 EIF2AK2 敲除组中减弱。通过肝组织 H&E 染色进行的组织学检查表明，BBR 对 EIF2AK2 敲除小鼠肝脏炎症浸润的改善作用减弱。这些发现表明，BBR 通过靶向 EIF2AK2 可能下调 IL-1β、IL-6、IL-18 和 TNF-α 的分泌，并显示出良好的安全性。
图 6：EIF2AK2 体内功能验证。
该研究充分展示了ABPP技术在阐明小檗碱等生物活性分子复杂机制方面的强大优势，推动了现代传统药物研究的进步。通过发现老药小檗碱的新靶点和作用机制，不仅丰富了我们对传统药物生物学功能的认识，也为炎症相关疾病的治疗开辟了新的视角和可能性。这一成果预示着，在ABPP等现代科学技术的支持下，更多的传统药物将通过明确其特定靶点和作用机制而被重新利用，为人类健康事业做出重大贡献。